基于網絡藥理學-分子對接探討保元湯調控線粒體功能治療冠心病的作用機制

劉啟予，樊懿萱，王彤歆，王安璐，徐 浩

冠心病是全球疾病負擔的重要組成部分，也是中老年人死亡的主要原因[1]，其發病機制主要為動脈粥樣硬化形成導致冠狀動脈管腔變窄甚至阻塞，引起心肌缺血、缺氧甚至梗死。由于線粒體在細胞氧化還原平衡及能量穩態中的核心作用，目前研究認為線粒體結構和功能異常與冠心病發生發展密切相關。觀察冠心病病人心肌細胞發現，線粒體DNA(mtDNA)完整性破壞，其編碼的呼吸復合物活性降低，電子傳遞鏈(ETC)紊亂，氧化磷酸化(OXPHOS)代謝異常，造成三磷酸腺苷(ATP)生成減少，活性氧生成增加[2]。一方面引起心臟供能不足，另一方面導致氧化應激、促進炎癥反應和細胞凋亡、血管內皮損傷等，影響動脈粥樣硬化形成[3-4]。保元湯始載于明代魏直《博愛心鑒》，后經張景岳等醫家發揮，其組方包括人參、黃芪、甘草、肉桂四味藥物，是治療冠心病等心血管疾病的常用方劑之一。“保元者，保守此元氣之謂也”，元氣者，人生立命之基也。張錫純指出“是大氣者，原以元氣為根本”，元氣足，大氣(即宗氣)得以充養，貫注于心脈之中，發揮行血氣之功以治療冠心病。現代藥理學研究顯示，保元湯通過抗細胞凋亡、抗氧化應激、改善血管內皮舒張功能、增加冠狀動脈血流量等發揮心肌保護作用[5-6]。富集保元湯對應的小鼠心肌保護靶點發現，多數靶蛋白均定位于線粒體，由此推測保元湯發揮心肌保護的核心機制可能是調節線粒體功能[7]。針對保元湯多靶點、多途徑綜合調節的作用特點，本研究運用網絡藥理學方法及分子對接技術，預測保元湯治療冠心病的有效成分、潛在靶點及信號通路，探討保元湯如何通過調控線粒體功能改善冠心病。

1 資料與方法

1.1 中藥的活性成分及相應靶點篩選 運用北京蛋白質組研究中心開發的在線生物信息學分析工具BATMAN-TCM平臺(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm)分別檢索“人參”“黃芪”“甘草”“肉桂”的有效成分及對應的潛在靶點，設置檢索參數為Score cutoff≥48、P<0.05進行篩選。

1.2 疾病靶標獲取 在人類基因數據庫(GeneCards，https://www.genecards.org/)、人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM，https://omim.org/)中以 “coronary heart disease”為檢索詞進行檢索，將兩個數據庫所得結果合并去重，最終得到冠心病的相關靶標。

1.3 “有效成分-作用靶點”網絡構建 將疾病靶標與藥物靶點進行比對，篩選兩者交集基因，獲得保元湯治療冠心病的作用靶點。運用Excel表格將作用靶點與藥物成分進行映射，并將其對應關系整合至Cytoscape 3.7.2軟件構建“中藥成分-作用靶點”網絡圖，對網絡進行拓撲分析，計算自由度(degree)預測關鍵靶點。

1.4 蛋白互作網絡圖構建及聚類分析 運用STRING數據庫(https://string-db.org/)分析作用靶點之間的相互作用關系，繪制蛋白互作網絡(PPI)，設定物種為“Homo sapiens”，互作評分為“medium confidence(0.400)”，去除無相互作用的靶蛋白，其余參數保持默認值。導入Cytoscape 3.7.2軟件進行聚類分析，運用MCODE插件識別功能模塊，設定參數degree≥2，K-Core≥2進行篩選。該插件可測定大型蛋白質互作網絡中的關系密集區域，從而預測可能表達的分子復合物，使后續功能注釋具有針對性和準確性[8]。

1.5 基因本體(GO)分析和基于京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 利用R 3.6.2軟件對上述聚類結果分別進行富集分析，運用Cluster Profiler軟件包進行GO功能注釋和KEGG富集分析，設定參數為P≤0.05，Q≤0.05，并進行可視化。

1.6 分子對接 選擇degree≥30的化合物及靶點進行分子對接，在中醫系統藥理學技術平臺(TCMSP)、Drugbank平臺中搜索化合物結構，保存為mol2文件。陽性對照藥物選擇曲美他嗪(trimetazidine，TMZ)，在Drugbank平臺中得到曲美他嗪的mol2文件。該藥可提高冠心病病人心肌細胞對糖的利用能力，使細胞合成ATP增多，能量供應增強[9]。將關鍵靶點導入PDB網站(http://www.rcsb.org/)，通過放射度(R值)篩選得到對應的靶點蛋白，保存蛋白結構為pdb文件。將mol2及pdb文件導入CB-Dock在線對接平臺(http://cao.labshare.cn/cb-dock/)進行分析并可視化，其對接結果主要參考Vina分數(Vina score)與空腔大小。

2 結 果

2.1 保元湯治療冠心病的活性成分及作用靶點預測 運用BATMAN-TCM平臺進行檢索，共篩選出保元湯活性成分195個及相應潛在靶點717個。在GeneCards數據庫、OMIM數據庫中共提取冠心病相關靶標4 010個。將藥物潛在靶點與疾病相關靶標取交集，共預測341個保元湯治療冠心病的作用靶點，對應有效藥物成分190個，其中作用于靶點數量超過30個的有效成分共11個。詳見表1。

表1 保元湯治療冠心病的主要有效成分

2.2 藥物成分-作用靶點網絡圖構建 運用Cytoscape 3.7.2軟件對保元湯作用于冠心病的有效成分與靶點間的互作關系進行可視化及拓撲分析。有效成分-作用靶點網絡圖中，共包括531個節點(190個成分節點，341個靶點節點)、1 524條邊。詳見圖1。對網絡進行拓撲分析，圖中節點大小反映度值大小，節點度值越大表示其在治療中可能越關鍵。故篩選出核心基因(degree值≥16)共23個。詳見表2。

圖1 有效成分-作用靶點網絡圖

表2 核心基因序列

2.3 PPI網絡構建及聚類分析 將獲得的341個作用靶點全部導入STRING數據庫中，得到靶蛋白之間PPI。為識別該復雜蛋白互作圖中的主要功能模塊，將PPI導入Cytoscape 3.7.2軟件中進一步聚類分析，運用MCODE算法共識別子簇14個并進行可視化，其中K-Core≥4的子簇共6個，其互作網絡及相關靶點詳見表3、圖2。

圖2 關鍵子簇的靶點互作圖

表3 PPI網絡中的關鍵子簇

2.4 GO生物過程及KEGG通路富集分析 運用R 3.6.2軟件對上述6個子簇進行GO及KEGG富集分析。結果顯示：子簇1主要參與的生物過程(biological process，BP)為G蛋白偶聯受體信號通路、偶聯環核苷酸第二信使、腺苷酸環化酶調節G蛋白偶聯受體信號通路、腺苷酸環化酶抑制G蛋白偶聯受體信號通路等，涉及的信號通路為神經活性配體與受體間的相互作用、cGMP-PKG信號通路、cAMP信號通路；子簇2主要參與的BP為血管收縮、血管直徑負性調節、調節血管直徑，涉及的信號通路為神經活性配體與受體間的相互作用、鈣信號通路、Toll樣受體信號通路等；子簇3主要參與的BP為活性氧代謝過程、腺苷酸環化酶激活G蛋白偶聯受體信號通路、對脂多糖的反應，涉及的信號通路為流體切應力和動脈粥樣硬化、前列腺癌、人類T細胞白血病病毒1感染等；子簇4主要參與的BP為心肌收縮力、離子跨膜轉運的調控、心臟傳導，涉及的信號通路為長壽調節通路、肥厚型心肌病、胰高血糖素信號通路等；子簇5主要參與的BP為心臟傳導、膜電位調節、參與收縮的心肌細胞動作電位等，涉及的信號通路為嘌呤代謝、腎素分泌、酪氨酸代謝等；子簇6主要參與的BP為核苷磷酸分解代謝過程、嘌呤核苷酸分解過程、含嘌呤的化合物分解代謝過程等，涉及的信號通路為嘌呤代謝、煙酸和煙酰胺代謝、嘧啶代謝等。詳見表4。

表4 關鍵子簇GO及KEGG富集結果

2.5 分子對接驗證 最終選擇5個關鍵靶點NR3C1、ATP1A1、AR、ESR1、PGR與上述保元湯主要有效成分進行分子對接驗證。所有化合物與靶點均具有一定的對接能力。Vina分數總體接近或低于曲美他嗪，且腔體大小基本與曲美他嗪接近，說明保元湯藥物成分與靶點結合能力較好，詳見表5、表6。化合物與PGR和AR的結合力較好。結合能居前7位的成分與靶點進行可視化分析，選擇配體小分子模式為“Spacefill”，受體蛋白模式為“Cartoon”，可見靶點蛋白與活性成分對接結構。詳見圖3～圖9。

表5 化合物和曲美他嗪與靶點對接的Vina分數

表6 化合物和曲美他嗪與靶點對接的腔體大小

圖3 Compound 10與NR3C1對接結果

圖4 Compound 10與ATP1A1對接結果

圖5 Compound 10與AR對接結果

圖6 Compound 10與ESR對接結果

圖7 Compound 10與PGR對接結果

圖8 Compound 6與PGR對接結果

圖9 Compound 1與PGR對接結果

3 討 論

冠心病屬中醫學“胸痹”范疇，其病機多以本虛標實為主，本虛多以氣虛為主，標實多以血瘀為主[10]。保元湯可補虛培元，氣旺則血行，運用以補為通之法治療胸痹。由于保元湯在臨床應用及實驗研究中表現出的良好治療作用，目前對相關機制的研究也越來越多。本研究利用網絡藥理學及分子對接方法進一步探討保元湯治療冠心病的作用機制，GO及KEGG富集分析結果顯示保元湯通過調控多條通路，作用于線粒體三羧酸循環、氧化磷酸化過程，影響細胞代謝(如能量代謝、活性氧代謝、嘌呤代謝)、細胞凋亡等過程，從而發揮保護心肌的作用。

有氧過程中線粒體通過OXPHOS產生約95%心臟所需的ATP[11]，缺氧期間線粒體功能損傷導致能量代謝改變。保元湯治療冠心病的主要成分包括三磷酸腺苷、腺苷、各類脂肪酸等，主要參與能量穩態調節。包裹在脂質體中的外源性ATP可有效減輕缺血性心肌損傷[12-13]。腺苷不僅參與調節能量代謝，并且具有自己的信號傳導功能[14]。外源性腺苷可協助恢復心肌缺血期間存活細胞的ATP水平；腺苷與其腺苷受體結合可改善心肌能量的供需平衡，提高O2的利用率，抑制炎癥級聯反應，減少活性氧合成，恢復鈣穩態，降低氧化應激，預防并減少血管內皮損傷，抑制血小板聚集等[15]。十三酸、十五烷酸、棕櫚酸、棕櫚油酸均屬于脂肪酸類，脂肪酸和葡萄糖是心肌所需供能的主要底物，底物的利用失衡均引起心臟收縮功能受損[16]。其中棕櫚油酸屬于單鏈不飽和脂肪酸類，通過降低肝脂肪變性，提高膽固醇流出能力等調節脂質代謝，下調促炎因子白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子α表達，抑制炎癥反應，從而延緩動脈粥樣硬化的發展[17]。

通過GO及KEGG富集分析結果顯示，得到不同子簇主要調控cAMP信號通路、cGMP-PKG信號通路、鈣信號通路等，參與能量代謝、氧化應激、嘌呤代謝、細胞凋亡等生物過程。子簇1主要調控G蛋白偶聯受體及其介導的cAMP、cGMP-PKG信號通路。G蛋白偶聯受體(GPCR)是最大的信號膜受體家族，可調節心血管、內分泌等方面的信號轉導。G蛋白可激活質膜上的腺苷酸環化酶(sAC)，將ATP轉化為cAMP。子簇1中ADORA1、DRD2、HTR1A、MTNR1A、ADRA2A、CHRM2、MTNR1B、HTR1B等基因均通過G蛋白信號轉導，下調sAC活性，減少cAMP信號通路傳導。cAMP信號通路中主要的效應子為蛋白激酶(PKA)，可使ETC中復合物磷酸化，造成OXPHOS異常；通過調節線粒體基因轉錄及表達，調控線粒體的生物發生，最終影響能量代謝[18]。sAC激活及PKA磷酸化均促進Bax向線粒體移位，誘導細胞色素C釋放，Caspase-9裂解，引起細胞凋亡[19]。cGMP-PKG信號通路在內源性心臟保護的信號轉導中發揮著關鍵作用，抑制線粒體Ca2+超載，降低復氧過程中Ca2+峰值和Ca2+振蕩，抑制膜通透性改變，限制細胞凋亡，同時減少心肌過度收縮[20]；減少內皮性一氧化氮合酶(eNOS)解偶聯，抑制氧化應激[21]。腺苷可激活cGMP-PKG信號通路，增加一氧化氮生成，抑制線粒體通透性過渡孔(mPTP)開放，從而達到調節能量穩態的目的[22]。

子簇2主要參與血管內皮調節及鈣信號傳導的生物過程。Ca2+信號轉導是線粒體調節細胞代謝的關鍵因素。線粒體Ca2+攝取可影響胞漿Ca2+瞬變、Ca2+振蕩的形成，進而調節心肌收縮功能[23]。線粒體Ca2+可調控丙酮酸脫氫酶復合物(MDH)等三羧酸循環相關酶及線粒體ATP合酶的活性，同時引起胞漿NADH增加，刺激電子傳遞鏈傳導，增加能量生成[24-26]。若鈣穩態失衡，線粒體內膜上鈣離子單向轉運蛋白(MCU)表達增加，線粒體Ca2+超載，導致ETC失調，電子泄漏增加，同時谷胱甘肽還原酶等抗氧化劑活性抑制，最終活性氧生成過多，引起氧化應激[27]；導致mPTP開放，Ca2+外流，造成膜電位和ATP產生破壞，同時細胞色素C等線粒體相關凋亡蛋白釋放，誘導細胞凋亡[28]。

子簇3主要參與活性氧的代謝過程。90%的活性氧均由ETC產生[29]。正常情況下，電子傳遞形成ATP的過程中，僅有不到0.1%的質子泄漏，與強氧化劑氧分子結合形成超氧化物，同時還原型輔酶Ⅱ及其氧化形式(NADPH/NADP+)和谷胱氨肽及其氧化型(GSH/GSSG)等及時清除活性氧，維持體內氧化還原水平[30]。線粒體中mtDNA編碼異常，復合物Ⅰ、Ⅲ結構及功能異常，膜電位降低，Ca2+超載及mPTP開放等情況均引起ETC紊亂，OXPHOS異常，氧化還原失衡，活性氧生成增多，從而誘發氧化應激，進一步造成低密度脂蛋白氧化增加、巨噬細胞極化、內皮功能障礙，促進動脈粥樣硬化形成[31]。

子簇4、子簇5主要參與調節心肌收縮力、信號傳導等生物過程，神經細胞興奮后產生的動作電位傳遞到心肌細胞，經過興奮-收縮耦聯，細胞外Ca2+內流，肌漿網終池釋放大量Ca2+，最終使肌絲滑行，心肌發生收縮。子簇5、子簇6同時參與嘌呤代謝、氨基酸代謝等過程。腺嘌呤和鳥嘌呤主要參與細胞DNA和RNA合成，氧化后生成次黃嘌呤和黃嘌呤，經過黃嘌呤氧化酶再氧化生成尿酸。缺血/缺氧可介導此過程中生成大量氧自由基和過氧化氫，降低一氧化氮生物利用度，引起氧化應激[32]。

分子對接結果顯示，主要化合物與相關靶標對接良好。PGR作為雌激素受體，可能與冠心病的性別差異相關[33]；AR參與ATP酶結合，調節能量代謝；NR3C1甲基化狀態對急性冠脈綜合征預后可能產生不良影響[34]；ATP1A1可催化ATP水解，為細胞提供能量；ESR1是冠心病的候選基因[35]。其中化合物三磷酸腺苷、α-三羥基糞甾烷酸與PGR和AR的結合力較好，與陽性對照藥曲美他嗪相比，對接效果更佳。相關研究顯示，曲美他嗪可降低氧化應激反應，減輕炎癥反應，提高冠心病病人心肌能量代謝和心臟功能等[36-37]。本研究結果顯示，保元湯對線粒體功能有一定調控功能，也對冠心病病人具有較好的心肌能量供應和保護作用，與相關研究結果[7]一致。

本研究綜合網絡藥理學和分子對接方法，預測保元湯治療冠心病的活性成分、作用靶點、信號通路。根據得到的結果初步發現保元湯通過多成分、多靶點、多通路方式調控線粒體三羧酸循環、氧化磷酸化過程，進而調節能量代謝、活性氧代謝、細胞凋亡等發揮保護心肌的作用，為進一步明確冠心病發病機制和治療原則提供新思路。