外周血miR-34a、SIRT1水平與腦梗死后認知功能障礙的關系

朱艷玲，孫 強，郝文莉，劉曉琳

腦梗死是臨床常見的心腦血管疾病，好發于高齡人群，是由于腦部血液供應障礙、缺氧缺血引起局限性腦組織腦軟化或缺血性壞死疾病，導致病人頭痛、耳鳴、眩暈、半身不遂等癥狀[1-2]。有研究顯示，15%～50%的腦梗死病人并發認知功能障礙，隨著老齡化社會的到來，腦梗死后認知功能障礙病人不斷增加，嚴重影響病人及家庭的正常生活[3]。微小RNA(microRNA)是不具備編碼功能的小分子RNA，通過調控靶基因表達參與調控細胞功能[4]。有研究表明，沉默信息調節因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是miR-34a作用的靶基因之一，二者在腫瘤發生發展過程中發揮著重要作用[5]。相關研究顯示，miR-34a參與慢性腦功能障礙疾病的發生發展，SIRT可發揮神經保護作用，抑制大鼠腦缺血再灌注損傷[6-7]。關于二者在腦梗死后認知功能障礙中作用的研究較少。本研究檢測腦梗死病人外周血miR-34a、SIRT1水平，探討二者與認知功能障礙的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年9月—2019年11月我院收治的腦梗死后認知功能障礙病人145例作為研究對象(觀察組)，同期腦梗死未發生認知功能障礙病人145例作為對照組。收集病人一般資料，包括性別、年齡、體質指數(body mass index，BMI)。

1.1.1 納入標準 符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[8]診斷標準，并經實驗室、影像學或磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)等檢查證實；病人及家屬知情并簽署知情同意書；本研究經過醫院倫理委員會審批，符合相關倫理學規定。

1.1.2 排除標準 合并心、肝、腎等重要臟器功能障礙、顱內感染、癲癇等其他影響實驗指標的疾病；既往有精神障礙史、認知功能障礙史、抑郁史；理解能力差或有視覺障礙、嚴重失語、聽力障礙等不能配合完成各項評分測評；妊娠期、哺乳期女性；臨床資料不完善。

1.2 試劑與儀器 TRIzol試劑(貨號：QN2070-ZOG)購自北京百奧萊博科技有限公司；逆轉錄試劑盒(貨號：BPI01030)購自北京華大蛋白質研發中心有限公司；實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)試劑盒(貨號：DEM202-50T)購自北京拜爾迪生物技術有限公司；熒光定量PCR儀(型號：ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司；引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 血清miR-34a、SIRT1水平檢測 于病人入院后次日清晨抽取空腹外周靜脈血5 mL，分離血清。使用TRIzol試劑提取血清總RNA，紫外分光光度計測量RNA質量，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，檢驗合成cDNA質量。采用qRT-PCR法檢測血清miR-34a、SIRT1水平，以U6、GAPDH作為內參基因。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環40次。miR-34a正向引物：5′-TGGCAGTGTCTTAGCT-3′，反向引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；SIRT1正向引物：5′-CCCAGAACATAGACACGCTGGA-3′，反向引物：5′-ATCAGCTGGGCACCTAGGACA-3′；內參U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；內參GAPDH正向引物：5′-GATTCCACCCATGGCAAATTC-3′，反向引物：5′-AGCATCGCCCCACTTGATT-3′。采用2-ΔΔCt法計算血清miR-34a、SIRT1相對表達量。

1.4 認知功能評定標準 采用簡易智能精神狀態檢查量表(Simple Mental State Examination Scale，MMSE)評分、蒙特利爾認知評估量表(Montreal Cognitive Assessment Scale，MoCA)評定病人認知功能。MMSE評分總分為30分，27～30分為認知功能正常，21～26分為輕度認知功能障礙，10～20分為中度認知功能障礙，0～9分為重度認知功能障礙。MoCA評分總分為30分，27～30分為認知功能正常，≤26分為認知功能障礙。

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較 兩組性別、年齡、BMI比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組血清miR-34a、SIRT1表達水平比較 與對照組比較，觀察組血清miR-34a水平升高(P<0.01)，血清SIRT1水平降低(P<0.01)。詳見表2。

表2 兩組血清miR-34a、SIRT1水平比較(±s)

2.3 兩組MMSE評分、MoCA評分比較 與對照組比較，觀察組MMSE評分、MoCA評分降低(P<0.01)。詳見表3。

表3 兩組MMSE評分、MoCA評分比較(±s) 單位：分

2.4 影響腦梗死病人發生認知功能障礙的多因素分析 將腦梗死病人是否發生認知功能障礙作為因變量，以血清miR-34a、SIRT1水平為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，血清miR-34a水平是影響腦梗死病人發生認知功能障礙的獨立危險因素(P<0.05)，血清SIRT1水平是影響腦梗死病人發生認知功能障礙的保護因素(P<0.05)。詳見表4。

表4 影響腦梗死病人發生認知功能障礙的多因素分析

2.5 腦梗死后認知功能障礙病人血清miR-34a、SIRT1水平與MMSE評分、MoCA評分的相關性分析 相關性分析結果顯示，腦梗死后認知功能障礙病人血清miR-34a水平與MMSE評分、MoCA評分呈負相關(r值分別為-0.427、-0.441，P<0.05)；血清SIRT1水平與MMSE評分、MoCA評分呈正相關(r值分別為0.467、0.458，P<0.05)。詳見圖1～圖4。

圖1 腦梗死后認知功能障礙病人血清miR-34a水平與MMSE評分的相關性分析散點圖

圖2 腦梗死后認知功能障礙病人血清miR-34a水平與MoCA評分的相關性分析散點圖

圖3 腦梗死后認知功能障礙病人血清SIRT1水平與MMSE評分的相關性分析散點圖

圖4 腦梗死后認知功能障礙病人血清SIRT1水平與MoCA評分的相關性分析散點圖

2.6 腦梗死后認知功能障礙病人血清miR-34a水平與SIRT1水平的相關性分析 相關性分析結果顯示，腦梗死后認知功能障礙病人血清miR-34a水平與SIRT1水平呈負相關(r=-0.500，P<0.05)。詳見圖5。

圖5 腦梗死后認知功能障礙病人血清miR-34a水平與SIRT1水平的相關性分析散點圖

3 討 論

腦梗死是一種致殘率、死亡率較高的腦血管疾病，近年來隨著生活節奏加快及個人不良生活習慣導致病人發病率呈上升趨勢[1]。腦梗死發病機制復雜且具有突發性，易出現局部腦組織血液循環障礙，發生缺血缺氧性損傷及炎癥反應增強，造成腦部認知功能區域組織損傷，導致認知功能障礙發生[9]。MMSE評分、MoCA評分是臨床評定認知功能障礙的常用方法，兩者主要用于評估已發生認知功能障礙、病情較穩定的病人，腦梗死認知功能障礙早期篩查具有一定的局限性[10]。目前，腦梗死認知功能障礙早期篩查的特異性血液生化指標未統一，尋找與腦梗死認知功能障礙發生有關的指標，對臨床篩查疾病、預后評估具有重要意義。

miRNAs通過與靶基因非轉錄區域結合而降解或抑制mRNA表達，抑制靶基因表達，進而參與多種疾病的發生發展過程。姚寶珍等[6]研究表明，顳葉癲癇大鼠模型海馬中miR-34a表達水平上調，可能通過激活Notch1信號通路，導致神經元凋亡及神經膠質增多，進而參與癲癇的發生發展。本研究結果顯示，腦梗死后認知功能障礙病人血清miR-34a水平較未發生認知功能障礙腦梗死病人顯著升高，提示miR-34a可能與腦梗死病人發生認知功能障礙過程有關。

SIRT1是依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，在神經領域有廣泛研究，在神經損傷模型及記憶方面具有保護神經的作用[11]。鄧青山等[12]研究顯示，高壓氧治療通過增加SIRT1蛋白表達減輕β-淀粉樣蛋白對阿爾茨海默病小鼠的神經毒性損傷，改善學習記憶功能，發揮神經保護作用。趙忠惠等[13]研究表明，白藜蘆醇通過促進SIRT1表達抑制炎癥反應，發揮對蛛網膜下腔出血大鼠中樞神經系統保護作用。本研究結果顯示，腦梗死后認知功能障礙病人血清SIRT1水平較未發生認知功能障礙腦梗死病人顯著降低，提示腦梗死病人發生認知功能障礙可能與SIRT1表達不足有關。

本研究多因素回歸分析結果顯示，血清miR-34a水平是影響腦梗死病人發生認知功能障礙的獨立危險因素，血清SIRT1水平是保護因素，提示血清miR-34a水平升高、SIRT1水平降低可能增加腦梗死病人發生認知功能障礙的概率。相關性分析結果顯示，腦梗死后認知功能障礙病人血清miR-34a水平與MMSE評分、MoCA評分均呈負相關，血清SIRT1水平與MMSE評分、MoCA評分均呈正相關，提示血清miR-34a、SIRT1水平與腦梗死后認知功能障礙病人認知障礙程度密切相關。劉曉虹等[14]研究顯示，miR-34a通過靶向調節SIRT1表達，實現對高糖條件下骨髓間充質干細胞衰老的調控。馬璐等[15]研究表明，miR-34a水平升高后下調其靶蛋白SIRT1的表達，可能與內皮祖細胞功能障礙發生相關。本研究進一步分析結果顯示，腦梗死后認知功能障礙病人血清miR-34a水平與SIRT1水平呈負相關，提示miR-34a和SIRT1與腦梗死后認知功能障礙病人發生過程關系密切，可能為靶向調節關系，仍需進一步研究驗證。

綜上所述，腦梗死后認知功能障礙病人外周血miR-34a、SIRT1水平均異常表達，可能共同調控腦梗死病人認知功能障礙發生，但二者的具體作用機制及相互關系需進一步研究。