脂聯素調控miR-221/Timp3信號對糖尿病腎病小鼠腎臟的保護作用*

馮 敏， 呂 琦， 林 婷， 陳霞霞， 楊小玲， 林開平， 溫俊平

（1福建省老年醫院內分泌科，福建福州350009；2福建省立醫院內分泌科，福建福州350001）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathies，DN）約占糖尿病患者的40%，是糖尿病最常見的慢性微血管并發癥之一，是導致慢性腎臟病的主要原因［1］。研究發現，血清脂聯素（adiponectin，ADPN）水平與糖尿病微血管并發癥的發生有密切聯系，ADPN可通過多種途徑保護高糖環境下的腎系膜細胞［2-3］，對延緩DN的進程具有重要意義。微小RNA-221（microRNA-221，miR-221）是與腎臟生理功能密切相關的調節性miRNA，參與了ADPN抑制腎系膜細胞增殖的過程［4］。生物信息學研究發現金屬蛋白酶組織抑制物3（tissue inhibitor of metalloproteinase 3，Timp3）是miR-221負調控的重要靶基因。Timp3在腎臟中高表達，是調控組織微環境和腎臟纖維化的重要因子，研究證實小鼠腎臟損傷和腎臟纖維化的發生與Timp3的表達缺失密切相關［5］。我們的前期研究發現，在體外高糖環境下，ADPN可通過下調miR-221靶向負調控Timp3表達來實現對小鼠腎系膜細胞的增殖抑制作用［6］。因此，本研究擬通過構建DN小鼠模型，探討ADPN在體內調控miR-221/Timp3信號對小鼠腎臟生理功能和病理狀態的影響，以期進一步揭示ADPN在DN中的保護機制。

材料和方法

1 動物

健康清潔級雄性C57BL/6小鼠36只，8周齡，體重約20~25 g，由福建醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK（滬）2012-0002。

2 主要試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自Sigma；血糖試紙購自強生公司；pcDNA 3.1質粒、Lipo?fectamine 2000脂質體和Trizol試劑均購自Invitro?gen；血清ADPN檢測試劑盒購自武漢云克隆科技公司；血清肌酐（serum creatinine，SCr）測定試劑盒購自Thermo Fisher；尿蛋白測定試劑盒購自R&D；Mir-X?miRNA First-Strand Synthesis Kit、Prime Script RT Master Mix和SYBR Advantage qPCR Premix均購自TaKaRa；miR-221抑制劑和miR-221抑制劑對照試劑均購自廣州銳博生物科技公司；抗Timp3和GAPDH鼠單克隆抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶標記的抗鼠II抗購自中杉金橋公司；引物由Invitrogen合成。

3 主要方法

3.1 DN小鼠模型的建立 36只清潔級C57BL/6小鼠，經標準飼料喂養、自由進食水、每日普通光照12 h的適應性飼養1周后，隨機抽取6只為正常對照組（control組），其余30只被用于建立DN小鼠模型：高脂高糖飼料喂養8周后，用0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH 4.2）溶解STZ，按35 mg/kg的劑量腹腔注射，每天1次，連續5 d。以隨機血糖≥16.7 mmol/L達3 d以上為糖尿病小鼠造模成功［7］。糖尿病小鼠模型在STZ注射4周以后，繼續高脂高糖喂養，每周留取一次24 h尿液標本，應用試劑盒測定24 h尿總蛋白（urine total protein，UTP）水平，當24 h UTP≥30 mg提示DN小鼠模型建立成功。

3.2 脂質體/pCMV-ADPN轉染復合物的制備 根據Lipofectamine 2000說明書，重組質粒pCMV-ADPN或pcDNA 3.1與脂質體按1μg∶0.5μL的比例配制成轉染復合物，用量根據小鼠體重按1μg/g的劑量進行腹腔注射，每周注射1次，連續8周，進行重組質粒pCMV-ADPN的轉染［8］。

3.3 實驗動物的分組與干預 造模成功后的DN小鼠根據干預因素的不同被隨機分為5組：（1）DN組：造模成功后不給予任何處理；（2）pCMV-ADPN轉染組（DA組）：造模成功后將配制好的脂質體/pCMVADPN轉染復合物腹腔注射入小鼠體內，每周1次，連續8周；（3）空載體組（DP組）：造模成功后將配制好的脂質體/pcDNA 3.1轉染復合物腹腔注射入小鼠體內，每周1次，連續8周；（4）miR-221抑制劑組（DM組）：造模成功后，根據小鼠體重按1μg/g的劑量，尾靜脈注射內源性miR-221抑制劑，每周1次，連續8周；（5）miR-221抑制劑對照組（DC組）：造模成功后尾靜脈注射miR-221抑制劑對照試劑，每周1次，連續8周。

3.4 血、尿標本和腎臟重量的檢測 各組連續干預8周后，稱取小鼠體重（body weight，BW）；每周一次將小鼠置于金屬代謝籠中，用代謝籠收集小鼠24 h尿液標本并檢測UTP水平；腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉小鼠后心尖采血并分離血清，檢測SCr和血清ADPN水平；采血后剖腹，經腹主動脈灌注生理鹽水后稱取腎臟重量（kidney weight，KW），由KW（mg）與BW（g）比值得出腎臟肥大指數（KW/BW）。

3.5 腎臟組織的病理學檢查 用10%水合氯醛按3 mL/kg的劑量腹腔注射，麻醉后取出雙腎，將部分腎組織經10%福爾馬林固定、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、4μm厚切片后，常規HE染色，在顯微鏡下觀察腎臟組織的病理學改變。

3.6 RT-qPCR檢測腎組織miR-221和Timp3 mRNA的表達 Trizol試劑一步法提取腎組織總RNA。采用逆轉錄試劑盒進行miR-221和Timp3的cDNA合成。應用SYBR Advantage qPCR Premix試劑盒進行PCR擴增（25μL的反應體系）。miR-221的上游引物序列為5'-AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC-3'，下游引物為Mir-X?miRNA First-Strand Synthesis Kit提供的通用引物mRQ 3'Primer；其內參照U6的上游引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。Timp3的上游引物序列為5'-CGTGCAGTACATTCACACG?GAAG-3'，下游引物序列為5'-ACCCAGGTGGTAGC?GGTAATTG-3'；其內參照GAPDH的上游引物序列為5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3'，下游引物序列為5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。反應條件為：95℃30 s；95℃5 s，58℃1 min，40個循環。采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

3.7 Western blot檢測腎組織Timp3的蛋白表達將小鼠腎組織研磨后加入裂解液，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。取30μg總蛋白，進行10%SDS-PAGE，接著以300 mA電轉膜1.5 h，將蛋白轉移到醋酸纖維膜上。在室溫下應用5%的脫脂奶粉封閉醋酸纖維膜條2 h，分別與抗Timp3鼠單克隆抗體和抗GAPDH鼠單克隆抗體4℃孵育過夜，洗膜后分別與辣根過氧化物酶標記的抗鼠Ⅱ抗孵育1 h，加入ECL發光劑后在暗室曝光顯影，應用圖像分析掃描軟件對條帶進行灰度分析并計算蛋白相對表達量。

4 統計學處理

采用SPSS20.0統計軟件進行資料分析。計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示。組間均數比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 ADPN過表達對小鼠血清ADPN及腎功能的影響

DN小鼠成模后，與control組比較，DN組小鼠血清ADPN水平顯著降低（P<0.05），而24 h UTP水平顯著升高（P<0.05）；pCMV-ADPN連續干預8周后，與DP組比較，DA組小鼠血清ADPN水平顯著升高（P<0.05），而24 h UTP顯著降低（P<0.05）；DA組小鼠SCr水平雖有所降低，但與DP組比較差異無統計學顯著性（P>0.05），見表1。

表1 ADPN過表達后小鼠血清ADPN水平及腎功能的變化Table 1.The changes of serum ADPN level and renal function after over-expression of ADPN gene（Mean±SD.n=6）

2 ADPN過表達對小鼠體重、腎臟重量及腎臟肥大指數的影響

DN小鼠成模后，與control組比較，DN組小鼠體重顯著下降（P<0.05），腎臟重量顯著增加（P<0.05），KW/BW顯著升高（P<0.05）；pCMV-ADPN連續干預8周后，與DP組比較，DA組小鼠體重顯著增加（P<0.05），腎臟重量顯著減輕（P<0.05），KW/BW顯著降低（P<0.05），見圖1。

3 ADPN過表達對小鼠腎臟miR-221和Timp3表達的影響

DN小鼠成模后，與control組比較，DN組小鼠腎臟miR-221相對表達量顯著升高（P<0.05），而Timp3的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05）；轉染pCMV-ADPN后，與DP組比較，DA組miR-221表達被抑制（P<0.05），Timp3的mRNA和蛋白表達均顯著上調（P<0.05），見圖2。

Figure 1.The changes of body weight（BW），kidney weight（KW）and renal hypertrophy index（KW/BW）after over-expression of ADPN gene.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs DPgroup.圖1 ADPN過表達后小鼠體重、腎臟重量及腎臟肥大指數的變化

4 抑制miR-221對小鼠腎臟miR-221和Timp3表達水平的影響

miR-221抑制劑尾靜脈注射后，與DC組比較，DM組小鼠腎臟miR-221表達被抑制（P<0.05），而Timp3的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），見圖3。

5 抑制miR-221對小鼠腎功能的影響

miR-221抑制劑尾靜脈注射后，DM組小鼠SCr水平有所下降，但與DC組相比差異無統計學顯著性（P>0.05），而24 h UTP水平降低，與DC組相比差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 miR-221阻斷后小鼠腎功能的變化Table 2.The changes of renal function after treatment with miR-221 inhibitor（Mean±SD.n=6）

6 抑制miR-221對小鼠體重、腎臟重量及腎臟肥大指數的影響

與control組比較，DC組小鼠體重顯著下降（P<0.05），腎臟重量顯著增加（P<0.05），KW/BW顯著升高（P<0.05）；miR-221抑制劑尾靜脈注射8周后，與DC組比較，DM組小鼠體重顯著增加（P<0.05），腎臟重量顯著減輕（P<0.05），KW/BW顯著降低（P<0.05），見圖4。

7 ADPN過表達和抑制miR-221對小鼠腎臟組織病理形態的影響

光鏡下HE染色顯示，control組小鼠腎臟腎小球和腎小管結構正常，毛細血管清晰可見；造模成功后，DN組小鼠出現明顯的腎組織損傷，可見腎小球體積增大，系膜細胞增生，腎小管水腫明顯，部分腎小管上皮細胞見顆粒狀或空泡樣變性、萎縮、壞死；而分別給予pCMV-ADPN轉染和miR-221抑制劑干預后的DA組和DM組，腎組織病理損傷明顯減輕，表現為腎小管和腎小球損害明顯減輕，系膜細胞增生減少，見圖5。

Figure 2.The changes of renal expression of miR-221（A）and Timp3（B and C）after over-expression of ADPN gene.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs DPgroup.圖2 ADPN過表達后小鼠腎臟miR-221和Timp3表達水平的變化

討 論

DN是由于糖尿病患者腎臟中發生特定的病理改變和功能變化所導致的以尿蛋白增多、腎小球高濾過，逐漸發展為腎小球濾過率下降、SCr升高，最終出現腎衰竭為主要臨床表現的綜合征，其發生機制復雜，臨床治療手段有限。

Figure 3.The changes of renal expression of miR-221（A）and Timp3（Band C）after treatment with miR-221 inhibi?tor.Mean±SD.n=6.△P<0.05 vs DCgroup.圖3 抑制miR-221后小鼠腎臟miR-221和Timp3的表達變化

Figure 4.The changes of body weight（BW），kidney weight（KW）and renal hypertrophy index（KW/BW）after treatment with miR-221 inhibitor.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；△P<0.05 vs DCgroup.圖4 抑制miR-221后小鼠體重、腎臟重量及腎臟肥大指數的變化

Figure 5.The pathological changes of renal tissues after over-ex?pression of ADPN gene or treatment with miR-221 in?hibitor（HEstaining，×400）.圖5 ADPN過表達和抑制miR-221后小鼠腎臟組織的病理學變化

ADPN是由脂肪細胞分泌的一種生物活性多肽，具有抗炎和抗氧化應激等作用，其活性水平與高血糖所致腎臟細胞內炎癥、氧化應激損傷有關，可通過調控轉化生長因子的表達及AMPK信號通路減輕腎臟細胞內的氧化應激損傷［9-10］。在ADPN基因敲除的小鼠中，尿白蛋白增加、腎小球肥大和腎小管間質纖維化均更顯著［3］。在腎小管-間質纖維化小鼠模型的研究中發現，羅格列酮可通過提高ADPN水平而抑制炎癥因子釋放，并下調轉化生長因子β1（trans?forming growth factor-β1，TGF-β1）的表達，從而減緩DN進程和腎小管間質纖維化［11］。這些對動物模型的實驗研究表明，ADPN對延緩DN的發生發展具有重要作用，對DN的臨床治療具有潛在的應用價值。

miRNA是一類內源性非蛋白質編碼RNA分子，通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區互補結合，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，從而抑制靶蛋白的表達，對細胞增殖、凋亡、分化、代謝等發揮調控作用。研究發現，在高糖誘導的足細胞損傷中許多miRNA的表達水平可以發生改變，同時DN患者足細胞損傷與血液、尿液和腎臟中的miRNA表達水平之間具有顯著相關性［12］。已有研究表明，多個miRNA在DN的發生過程中起重要作用。在體外高糖環境的刺激下，腎系膜細胞增生伴有miR-34a表達增高，生長停滯特異性蛋白1（growth arrest-specific protein 1，GAS1）是miR-34a的靶基因，抑制miR-34a/GAS1信號可抑制腎系膜細胞的增生和腎小球的肥大［13］。另有研究顯示，抑制miR-135a表達也能夠降低DN中腎系膜細胞的增殖和細胞外基質的聚集，進而阻止腎臟纖維化［14］。在經TGF-β處理的腎系膜細胞中，miR-216a、miR-217和miR-200均表達上調，并能夠激活PI3K/Akt信號通路，引起腎系膜細胞增生、肥大及細胞外基質的生成［15］。隨著miRNA的發現以及miRNA失調在DN發病機制中的重要作用，越來越多的證據顯示miRNA可能是DN潛在的生物學標志物及藥物治療新靶點［16-17］。基于此，我們在前期的體外實驗中，篩選出能夠參與改善胰島素抵抗作用并受ADPN信號調控的miR-221作為研究對象，經過生物信息學技術和螢光素酶報告基因實驗驗證Timp3是miR-221的靶基因，并經體外研究證實在高糖培養環境下小鼠腎系膜細胞的增殖與miR-221的表達水平呈正相關，且這種增殖效應能夠被ADPN抑制，在減緩細胞增殖的同時，ADPN可顯著抑制miR-221并上調Timp3基因的表達［6］。同期有研究發現，在DN足細胞損傷的過程中，miR-221通過直接靶向DKK2（Dickkopf-related protein 2）基因的表達，調控Wnt/βcatenin信號并介導近端小管細胞的損傷［18］。

Timp3是TIMPs家族在腎臟中表達水平最高的一種細胞因子。Timp3基因表達缺失的小鼠模型表現出對腎臟纖維化的敏感性增高；Timp3的表達上調可抑制高糖刺激下腎小管導管上皮細胞的纖維化進程［19］。Timp3表達缺失能夠加重DN小鼠的腎臟損害，主要表現為間質性腎炎、間質纖維化、腎臟重量增加、腎小球系膜基質增厚、尿蛋白排泄增加等［20-21］。為驗證在體內環境下ADPN是否通過調控miR-221/Timp3信號對DN小鼠腎臟產生保護作用，本研究通過構建DN小鼠模型并轉染ADPN過表達質粒，觀察體內高ADPN水平對小鼠腎臟生理功能的影響。結果發現，經轉染pCMV-ADPN的DN小鼠，24 h UTP顯著低于轉染對照組，同時轉染后的DN小鼠體重增加，腎臟重量減輕，KW/BW降低，表明在ADPN的作用下，DN小鼠的腎臟生理功能得到明顯改善。進一步給予DN小鼠轉染miR-221抑制劑后，在24 h UTP水平、小鼠體重、腎臟重量及KW/BW等方面獲得了與ADPN作用一致的結果。以上實驗結果提示，ADPN對DN小鼠腎臟生理功能的改善作用與miR-221的介導密切相關。

此外，本研究應用RT-qPCR檢測小鼠腎組織發現，轉染pCMV-ADPN后，miR-221在DN小鼠腎組織中表達下調，而Timp3表達增強。Western blot實驗結果顯示在DN小鼠腎組織中Timp3蛋白表達水平與mi-221水平呈負相關，結合前期的螢光素酶報告基因實驗［6］，表明Timp3表達是受mi-221靶向負調控。給予miR-221抑制劑后，Timp3的表達改變與ADPN作用一致。由此可以證實ADPN對DN小鼠的腎臟保護作用是通過調控miR-221/Timp3信號來實現的。

基于腎系膜細胞增殖肥大、基底膜增厚及腎小球硬化是DN的基本病理特征［22］。在本研究中，DN小鼠造模成功后，DN小鼠出現明顯的腎組織損傷，表現為腎小球體積增大，系膜細胞增生，腎小管水腫，腎小管上皮細胞空泡樣變性、萎縮、壞死。在分別給予pCMV-ADPN轉染及miR-221抑制劑后，DN小鼠腎組織病理損傷明顯減輕，表現為腎小管和腎小球損傷明顯減輕，系膜細胞增生減少，提示ADPN可以改善DN小鼠腎臟的病理狀態，是ADPN在體內發揮腎臟保護作用的有力證據。

綜上所述，本研究從實驗動物水平上證實ADPN可以改善DN小鼠的腎臟生理功能和病理狀態，miR-221/Timp3信號調控是ADPN發揮作用的重要途徑。ADPN調控該信號有望成為DN的治療新靶點，為DN的防治提供新的思路。