Npas4在小鼠原代神經元體外氧糖剝奪/復氧損傷中的保護作用及其可能機制*

石子璇， 饒 維， 姬廣輝， 腰向穎△

（解放軍總醫院第六醫學中心1中醫內科，2神經外科，北京100048）

腦卒中是神經系統的常見急重癥，其流行率、發病率和死亡率均較高，已成為我國居民的首要死因及成人首要致殘原因［1-2］，而缺血性腦卒中在其中占比高達67.3%~80.5%［3］。盡管目前多種再灌注治療手段（如溶栓、取栓及閉塞再通等）在臨床廣泛應用，但目前仍缺乏有效的臨床干預靶點及神經保護藥物［4-5］。神經元PAS結構域蛋白4（neuronal Per-Arnt-Sim domain protein 4，Npas4）是堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子家族中的一員，幾乎僅表達于腦組織，參與調節抑制性突觸發育及突觸可塑性，在學習和記憶中發揮重要作用；同時，Npas4也是一種神經元興奮相關的即早基因，與多種神經退行性疾病關系密切［5］。部分研究也揭示Npas4可減輕缺血性腦損傷，具有一定的神經保護作用［6］。然而，神經元氧糖剝奪/復氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）損傷后，Npas4的表達規律及其具體作用目前尚不清楚。本項工作擬構建小鼠原代皮層神經元OGD/R模型，觀察損傷后Npas4的時間變化規律，并通過基因干預下調Npas4的表達，探討其在神經元OGD/R損傷中的作用及其可能機制。

材料和方法

1 實驗材料與主要試劑

C57BL/6孕鼠，孕14~15 d，22~25 g，SPF級，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證編號為SCXK（陜）-2019-001。神經元培養液（Neuro?basal?、B27和GlutaMAX?）及Dulbecco改良Eagle培養 液（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）（Thermo Fisher Scientific）；RNA提取、反轉錄及實時定量PCR試劑盒（TaKaRa）；細胞計數試劑盒8（Cell Counting Kit-8，CCK-8；上海生工生物工程公司）；Western blot試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；抗Npas4抗體（NeuroMab）；抗Homer1a抗體（Santa Cruz）；抗caspase-3和cleaved caspase-3抗體（Cell Signaling Technology）；無關序列（scramble）及Npas4短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒顆粒（上海吉凱基因化學技術有限公司）。

2 主要方法

2.1 小鼠原代皮層神經元培養 孕14~15 d C57BL/6小鼠予以頸椎脫臼處死，無菌條件下分離胎鼠皮層，置于含有預冷的DMEM中，剪碎后加入0.15%胰蛋白酶37℃孵箱酶解10 min，于DMEM（含10%胎牛血清）中終止酶解，54×g離心5 min，棄上清，重復終止酶解步驟1次，加入DMEM（含10%胎牛血清），輕柔吹打制備單細胞懸液，70μm細胞濾網過濾，接種于100 mg/L多聚賴氨酸包被的培養皿，置于37℃細胞培養箱培養；培養6 h后，更換為Neurobasal完全培養液，置于37℃細胞培養箱繼續培養，后每3 d半量換液，培養至第9天待用。

2.2 OGD/R模型制備 選取生長狀態良好的成熟原代神經元，更換培養液為無糖Neurobasal培養液，置于缺氧培養箱（氧濃度監測<1%，N∶2CO2=95%∶5%）中培養3 h后更換為Neurobasal完全培養液，正常培養箱（空氣∶CO2=95%∶5%）中培養至實驗所需時點后，予以下一步處理。

2.3 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測 采用Cytotoxicity Detection Kitplus進行LDH檢測，收集培養液上清離心，后取上清液100μL加入96孔板中，加入100μL工作液，震蕩后避光孵育30 min，加入50μL終止液，酶標儀（波長490 nm）測定吸光度（A）值，絕對測量值=測量值?空白對照值（正常完全培養液）。神經毒性（%）=（實驗組A值?低對照A值）（/高對照A值?低對照A值）×100%。（低對照：未處理組培養液上清液；高對照：未處理組加入酶解溶液后的培養液上清液；實驗組：處理組培養液上清液）。

2.4 Npas4-shRNA慢病毒載體的構建及感染Npas4-shRNA（5′-GGTTGACCCTGATAATTTA-3′）及其無關序列（5′-GGTTCAGCGTCATAATTTA-3′）載體構建及慢病毒包裹均委托于上海吉凱基因公司。待神經元培養至第5天，按梯度濃度加入慢病毒顆粒，6~8 h后予以換液，培養至第8天后造模并提取mRNA及蛋白，驗證轉染效率，選取合適的感染指數，后按此感染指數進行神經元基因干預造模。

2.5 RT-qPCR實驗 按照TaKaRa MiniBEST Uni?versal RNA Extraction Kit說明書提取RNA，濃度定量后，據說明書進行20μL體系反轉錄及25μL體系qPCR，待反應結束后，進行mRNA相對表達水平的分析。所使用引物均由TaKaRa合成：Npas4的上游引 物 序 列 為5′-CAGGATGACTCACACTGACAG?TATTTTTAG-3′，下游引物序列為5′-GTGGGAGA?AGAGCTATTTATATCACCAG-3′；Homer1a的上游引物序列為5′-GGCAAACACTGTTTATGGACTGG-3′，下游引物序列為5′-GTAATTCAGTCAACTTGAG?CAACC-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-GGGT?CAGAAGGATTCCTATG-3′，下 游 引 物 序 列 為5′-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3′。

2.6 Western blot檢測蛋白表達 使用RIPA裂解液（含1%蛋白酶及磷酸酶抑制劑）提取全細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，取20μL總蛋白行10%~12%SDS-PAGE，濕轉于醋酸纖維膜，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，分別加入I抗孵育過夜［Npas4（1∶500），Homer1a（1∶200），caspase-3和cleaved caspase-3（1∶1 000）及 β-actin（1∶4 000）］，PBST潤洗3次，加入Ⅱ抗，室溫孵育1.5 h，PBST洗膜3次，增強型HRP化學發光液顯影壓片，采用Gel-pro軟件進行各個蛋白的相對表達水平分析。

3 統計學處理

采用GraphPad Prism 6軟件進行統計分析及圖表制作，數據均以均數±標準誤（mean±SEM）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法。以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 OGD/R損傷后，小鼠原代皮層神經元中Npas4和Homer1a表達水平上調

與對照組相比，OGD/R損傷后原代皮層神經元胞體皺縮、空泡化，并出現部分突起連接斷裂，見圖1；OGD/R損傷早期，Npas4（OGD 3 h和OGD/R 1 h）及Homer1a（OGD/R 1 h、OGD/R 3 h和OGD/R 6 h）的mRNA水平顯著高于對照組（P<0.05），后逐漸恢復至正常水平，見圖2。我們進一步檢測其蛋白表達水平，Western blot結果顯示Npas4和Homer1a的蛋白表達與mRNA變化趨勢基本一致（P<0.05），見圖3。

Figure 1.Morphological changes of primarily cultured cortical neurons.The scale bar=50μm.Compared with con?trol group（left），significant morphological changes were observed in OGD 3 h group（right），including neuronal debris，vacuolation and breakdown of neuro?nal networks.圖1 原代皮層神經元的形態改變

2 Npas4-shRNA顯著降低OGD/R引起的Npas4表達上調

為明確Npas4在OGD/R中的作用，采用Npas4-shRNA下調Npas4的表達水平。OGD/R損傷后1 h，其mRNA及蛋白水平均達高峰，故此時點用于Npas4-shRNA下調效率驗證。與無關序列組相比，Npas4-shRNA可顯著降低OGD/R所引起的Npas4蛋白表達上調（P<0.05），見圖4，以此條件用于后續實驗。

Figure 2.The mRNA levels of Npas4 and Homer1a in neurons were up-regulated in the early stage of OGD/R injury.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group.圖2 OGD/R損傷早期神經元中Npas4和Homer1a的mRNA水平上調

Figure 3.The protein levels of Npas4 and Homer1a in neurons were up-regulated in the early stage of OGD/R injury.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group.圖3 OGD/R損傷早期神經元中Npas4和Homer1a的蛋白表達水平上調

3 下調Npas4加重OGD/R引起的神經元損傷

下調Npas4的表達后予以OGD/R造模，24 h后采用CCK-8檢測細胞活力，結果顯示，與對照組相比，OGD/R組神經元細胞活力顯著降低（P<0.05）；與OGD/R組及無關序列組相比，Npas4-shRNA組神經元細胞活力進一步降低（P<0.05），而OGD/R組與無關序列組間差異無統計學意義（P>0.05），見圖5A。進一步采用LDH釋放實驗檢測驗證神經元損傷情況，與對照組相比，OGD/R組LDH釋放顯著增加（P<0.05）；與OGD/R組及無關序列組相比，Npas4-shR?NA組LDH釋放進一步升高（P<0.05），OGD/R組與無關序列組間差異無統計學意義（P>0.05），見圖5B。

Figure 4.The expression of Npas4 was knocked down by trans?fection with Npas4-shRNA.The protein level of Npas4 at 1 h after OGD/R injury were detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs scramble+OGD/Rgroup.圖4 Npas4-shRNA敲減神經元中Npas4的表達

4 下調Npas4加重OGD/R誘導的神經元凋亡

進一步采用Western blot檢測凋亡相關蛋白的表達以明確神經元凋亡的改變，結果顯示，與OGD/R及無關序列組相比，Npas4 shRNA組中Bax/Bcl-2及cleaved caspase-3的蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），見圖6。

5 下調Npas4降低OGD/R引起的Homer1a表達上調

與對照組相比，OGD/R組Homer1a蛋白水平顯著上調（P<0.05）；與OGD/R組及無關序列組相比，Npas4-shRNA組Homer1a蛋白水平顯著降低（P<0.05），OGD/R組與無關序列組間蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05），見圖7。

Figure 5.Down-regulation of Npas4 aggravated neuronal injury after OGD/R.A：the cell viability was detected by CCK-8 assay；B：the LDH release was detected by Cytotoxicity Detection KitPLUS.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs scramble+OGD/R group.圖5 下調Npas4加重OGD/R引起的神經元損傷

討 論

Npas4是新近發現的鈣依賴性轉錄因子，參與調節突觸興奮-抑制的動態平衡，在神經環路的形成及調控突觸可塑性中發揮重要作用。本研究通過體外培養的小鼠原代皮層神經元建立OGD/R模型，模擬腦缺血再灌注損傷，揭示Npas4在OGD/R損傷中可能發揮重要的調控作用。

既往研究表明，Npas4可被多種應激條件快速誘導表達，如神經元興奮、癲癇及缺血等［7-8］。本研究顯示，OGD/R損傷可引起Npas4的表達動態升高——損傷早期顯著升高，后逐步恢復至生理水平。而神經元興奮-抑制失衡，即興奮性毒性，是腦缺血性損傷的關鍵致傷機制；同時，已有研究表明Npas4可增強抑制性突觸傳遞，是神經元興奮-抑制平衡重要調節分子［4，9］。據此，我們推測OGD/R損傷后，誘導高表達的Npas4可能通過減輕神經元興奮-抑制失衡，從而減輕興奮性毒性而發揮神經保護作用。進一步的Npas4基因干預實驗也證實上述推論。慢病毒介導的Npas4表達下調，加重OGD/R所引起的神經元損傷，包括神經元活性降低、LDH釋放量增加及細胞凋亡增加。因此，我們推測Npas4可減輕OGD/R誘導的神經元損傷。

Figure 6.Down-regulation of Npas4 aggravated neuronal apopto?sis after OGD/R.The protein levels of Bax，Bcl-2，caspase-3 and cleaved caspase-3 at 1 h after OGD/R injury were detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs scramble+OGD/Rgroup.圖6 下調Npas4加重OGD/R引起的神經元凋亡

Figure 7.Down-regulation of Npas4 inhibited the up-regulation of Homer1a induced by OGD/R.The protein expres?sion of Homer1a at 1 h after OGD/R injury were de?tected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs scramble+OGD/Rgroup.圖7 下調Npas4抑制OGD/R引起的Homer1a表達上調

作為一重要的轉錄調控因子，Npas4的神經保護作用機制及其下游效應分子仍需進一步探討。既往研究提示，Homer1a是突觸興奮-抑制平衡的重要直接調控分子，也是神經元興奮性損傷的重要保護分子，然而其具體表達調控機制仍尚不清楚［10-13］。部分研究提示，Npas4與Homer1a基因啟動子存在相互作用［14-15］；此外，腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）不僅是Homer1a的表達上調分子，同時也是Npas4重要的靶基因之一［7］。據此，我們推測Npas4可能通過上調Homer1a的表達，從而減輕OGD/R介導的神經元興奮性損傷。我們的研究結果表明，OGD/R損傷后，Npas4的mRNA與蛋白表達高峰均早于Homer1a，提示Npas4可能誘導Homer1a表達；同時，下調Npas4的表達后，Homer1a的表達水平也顯著降低。總結上述結果，OGD/R損傷后，Npas4的表達上調，并可能通過上調Homer1a的表達，從而調控神經元興奮-抑制平衡發揮神經保護作用。

綜上所述，OGD/R損傷后，Npas4表達呈動態上調，且可能通過上調Homer1a發揮一定的神經保護作用。然而，本研究僅通過基因下調反向證明Npas4的神經保護作用，Npas4過表達及其在體腦缺血再灌注實驗仍需進一步完成，以闡明Npas4在腦缺血再灌注損傷中的確切作用及機制，為腦缺血治療提供一定的參考資料。