Prdx1基因敲減促進氧糖剝奪/復氧誘導的小鼠神經母細胞瘤N2a細胞凋亡*

王海鵬， 劉同帥， 于 群， 張佳文， 王明山△

（1青島大學附屬青島市市立醫院麻醉科，山東青島266071；2濰坊醫學院麻醉學院，山東濰坊261053；3南京醫科大學青島臨床醫學院，山東青島266071）

腦血管疾病以其高致殘率和高致死率病一直是危害我國中老年人身體健康和生活質量的主要疾病，其中以缺血性腦卒中為主，發病比例約占70%［1］。缺血腦組織恢復血液灌注后，原有損傷可進一步加重，稱為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reper?fusion injury，CIRI）。目前研究表明，活性氧（reac?tive oxygen species，ROS）形成是引起腦缺血再灌注后神經元損傷和死亡的重要機制之一［2-3］，過氧化還原蛋白1（peroxirodoxin 1，Prdx1）作為抗氧化蛋白超家族中的一員，在細胞內參與ROS相關的多種信號通路的調節，發揮抗氧化和清除自由基的功能［4］。Wu等［5］研究表明，在大鼠大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）再灌注及離體大腦皮層神經元氧糖剝奪/復氧（oxygen-glucose depriva?tion/reoxygenation，OGD/R）模擬的腦缺血再灌注損傷模型中，Prdx1表達量皆顯著上調。本項工作以小鼠神經母細胞瘤N2a細胞為研究對象，通過構建OGD/R模型模擬腦神經元缺血再灌注損傷過程，探討Prdx1基因敲減對OGD/R誘導的離體小鼠神經母細胞瘤N2a細胞凋亡的影響及作用機制。

材料和方法

1 細胞株和主要試劑

小鼠神經母細胞瘤N2a細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。高糖、無糖DMEM培養液及PBS磷酸緩沖液均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自BioInd；細胞增殖與毒性試劑盒（CCK-8）購自上海七海復泰生物科技有限公司；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒及DAPI染色液均購自碧云天生物技術有限公司；c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）抑制劑SP600125購自MCE；MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptRT reagent Kit和TB Green Premix Ex TaqII均購自TaKaRa；riboFECT CPTrans?fection Kit、小鼠特異性siRNA及陰性對照序列片段均購自廣州銳博生物技術有限公司；二甲基亞砜及RIPA裂解液均購自北京索萊寶公司；ECL發光試劑盒、山羊抗兔的II抗及山羊抗鼠的II抗均購自北京中杉金橋生物技術公司；兔抗小鼠Prdx1、JNK、磷酸化JNK（phosphorylated JNK，p-JNK）、cleaved cas?pase-3和β-actin單克隆抗體購自Abcam。

2 主要方法

2.1 N2a細胞培養及實驗分組 在5%CO2、95%空氣、37℃、飽和濕度的培養箱中，用含有10%FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM完全培養液對N2a細胞進行培養。培養液每24 h更換1次，2 d后按1∶3比例傳代，在保證細胞達到實驗密度并處于生長對數期的狀態下，按不同實驗要求處理細胞。實驗中細胞隨機分為正常對照（control）組（常規培養，無操作處理）、OGD/R組（無糖培養液、無氧環境中行氧糖剝奪處理8 h，然后恢復常氧常糖培養24 h）、OGD/R+JNK抑制劑（SP600125）組（氧糖剝奪之后復糖復氧同時予10μmol/L SP600125處理，其余培養條件同OGD/R組）、OGD/R+陰性對照序列（siNC）組（瞬時轉染陰性對照序列48 h后行OGD/R處理）、OGD/R+siPrdx1組（瞬時轉染siPrdx1 48 h后行OGD/R處理）和OGD/R+siPrdx1+SP600125組（在瞬時轉染siPrdx1且氧糖剝奪之后復糖復氧同時予10μmol/L SP600125處理，其余培養條件同OGD/R組）。

2.2 N2a細胞OGD/R模型的建立 OGD/R模型制備參考文獻［6-7］，并加以改良。根據我們的前期研究，N2a細胞在氧糖剝奪8 h再復糖復氧24 h后，細胞活力顯著降低。因此，采用氧糖剝奪8 h再復糖復氧24 h的N2a細胞損傷模型進行后續研究。選取生長良好的N2a細胞，棄掉原有培養液，用PBS清洗細胞3次，更換為無糖DMEM培養液，置于缺氧罐內，以5%CO2和95%N2混合氣體置換缺氧罐內空氣，于37℃、飽和濕度培養箱內氧糖剝奪8 h。之后，取出細胞將無糖DMEM培養液更換為含10%FBS的高糖DMEM培養液，在5%CO2、95%空氣、37℃、飽和濕度培養箱內培養24 h模擬復氧過程。

2.3 轉染N2a細胞 由廣州銳博生物技術有限公司設計并合成Prdx1特異性siRNA及陰性對照序列，siPrdx1序列為5'-GCACCATTGCTCAGGATTA-3'。提前1 d將處于對數生長期的細胞接種在含有完全DMEM培養液的多孔板，使次日轉染時細胞密度達到30%~50%。根據riboFECT CP Transfection Kit說明書，更換完全培養液為無雙抗培養液，將轉染試劑分別與特異性及陰性對照siRNA混合，室溫孵育15 min后制備成轉染復合物并加入多孔板中，輕輕混勻。將培養板置于37℃、5%CO2、95%空氣、飽和濕度培養箱中繼續培養48 h，于熒光顯微鏡下觀察是否轉染成功，并通過RT-qPCR及Western blot檢測敲減效率。

2.4 CCK-8法檢測細胞活力 將100μL N2a細胞懸液以每孔4 000個細胞接種到96孔板。在37℃、5%CO2、95%空氣、飽和濕度培養箱中培養24 h。實驗處理后，每孔加10μL CCK-8溶液，于37℃細胞培養箱內避光孵育2 h，用酶標儀測定450 nm處吸光度（absorbance，A），每組取6個復孔，設置無細胞空白對照孔，以正常組細胞活力為100%，實驗組細胞相對活力（%）=（A實驗組?A空白組）（/A對照組?A空白組）×100%。

2.5 TUNEL染色檢測凋亡 取對數生長期的N2a細胞，以每孔2×104個接種于12孔板，每孔細胞懸液1 mL；培養24 h后，分組處理細胞；棄培養液，PBS洗滌1次，4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗滌1次，加入含0.3%Triton X-100的PBS，室溫孵育5 min；PBS洗滌2次，將5μL TdT酶與45μL熒光標記液混合配制成50μL TUNEL檢測液，加入孔中，37℃避光孵育60 min；PBS洗滌3次，加入少量DAPI染色液，覆蓋住樣品，室溫放置5 min，吸除DAPI染色液，PBS洗滌3次；封片后立即在熒光顯微鏡下觀察。在200倍鏡下，隨機取6個視野，計數呈現綠色熒光的凋亡細胞，取平均值，細胞凋亡指數=凋亡細胞數/視野下細胞總數。

2.6 RT-qPCR 按照MiniBEST Universal RNA Ex?traction Kit說明書操作提取各組細胞總RNA，紫外分光光度法檢測總RNA純度及濃度，取1μg RNA為模板，使用PrimeScript RT reagent Kit進行逆轉錄獲得cDNA。使用TB Green Premix Ex TaqⅡ試劑盒進行RT-qPCR，反應總體系20μL，包括：TB Green Premix Ex TaqⅡ10μL，上、下游引物各0.8μL，cDNA溶液2μL，滅菌水6μL。反應條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃31 s，共40個循環。Prdx1及β-actin引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。Prdx1的上游引物序列為5'-CTTCTGTCATCTGGCATG?GATTAAC-3'，下游引物序列為5'-AAGACTCCATA?ATCCTGAGCAATGG-3'，產物長度為114 bp；β-actin的上游引物序列為5'-TCAGCAAGCAGGAGTAC?GATG-3'，下游引物序列為5'-ACGCAGCTCAGTAA?CAGTCC-3'，產物長度為81 bp。采用2?ΔΔCt法計算Prdx1 mRNA的相對表達量。

2.7 Western blot 將待測細胞樣品加入300μL的RIPA裂解液，充分混勻，4℃冰箱裂解2 h。于4℃、16 100×g離心10 min，取上清備用。BCA法測定蛋白濃度，取50μg總蛋白進行SDS-PAGE，再轉移到PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉2 h，加入I抗稀釋液4℃搖床孵育過夜；TBST洗膜3次，加入Ⅱ抗稀釋液，室溫孵育90 min；TBST洗膜3次，加入ECL試劑，曝光、顯影、定影處理。以β-actin為內參照。所得條帶使用Perfection V19型掃描儀（Epson）掃描，通過ImageJ軟件進行灰度值分析，計算各蛋白的相對表達量。

3 統計學處理

采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析，采用GraphPad Prism 8.0軟件繪圖。實驗計量資料結果以均數±標準差（mean±SD）表示。各指標數據經分析均為正態分布且方差齊，多組間數據比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 siPrdx1轉染N2a細胞的效率

1.1 熒光顯微鏡觀察siRNA轉染的有效性 以熒光基團Cy3標記的siRNA轉染N2a細胞，以DAPI標記細胞核，在熒光顯微鏡下觀察到90%以上的細胞發出明亮紅色熒光，分布均勻，表明共培養48 h時siRNA可以成功轉染N2a細胞，見圖1。

1.2 RT-qPCR檢測轉染效率 以siPrdx1轉染N2a細胞，48 h后提取細胞總RNA，RT-qPCR檢測Prdx1的mRNA表達情況，與control組比較，轉染siNC組細胞Prdx1的mRNA表達無顯著差異，而轉染siPrdx1組細胞Prdx1的mRNA表達顯著降低（P<0.05），見圖2。這一結果顯示我們獲得了Prdx1基因敲減的N2a細胞。

1.3 Western blot檢測轉染效率 以siPrdx1轉染N2a細胞，48 h后提取細胞總蛋白，Western blot檢測Prdx1蛋白表達情況，與control組比較，轉染siNC組細胞Prdx1蛋白表達無顯著差異，而轉染siPrdx1組細胞Prdx1蛋白表達顯著降低（P<0.05），見圖3。這從蛋白水平進一步證明我們獲得了Prdx1基因敲減的N2a細胞。

2 Prdx1敲減對OGD/R誘導的N2a細胞活力的影響

CCK-8結果顯示，與control組比較，OGD/R處理組N2a細胞活力顯著降低（P<0.05）；OGD/R處理后，轉染siNC組N2a細胞活力與單純OGD/R處理組比無顯著差異，而轉染siPrdx1組N2a細胞的活力進一步降低（P<0.05），見圖4。

Figure 1.The fluorescence images of N2a cells transfected with siRNA for 48 h.The red fluorescence represents the N2a cells that have been successfully transfected with Cy3-labeled siRNA.The blue fluorescence represents the nuclei of all N2a cells stained with DAPI.The scale bar=50μm.圖1 siRNA轉染N2a細胞48 h的熒光圖片

Figure 2.The transfection efficiency of siPrdx1 in N2a cells was detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group.圖2 RT-qPCR檢測siPrdx1轉染N2a細胞的效率

3 Prdx1敲減對OGD/R誘導的N2a細胞凋亡的影響

TUNEL熒光染色結果顯示，與control組比較，OGD/R處理組凋亡N2a細胞的數目顯著增多（P<0.05）；OGD/R處理后，轉染siNC組凋亡N2a細胞的數目與單純OGD/R處理組比較無顯著差異，而轉染siPrdx1組凋亡N2a細胞的數目進一步增多（P<0.05），見圖5。

Figure 3.The transfection efficiency of siPrdx1 in N2a cells was detected by Western blot.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group.圖3 Western blot檢測siPrdx1轉染N2a細胞的效率

Figure 4.The effect of Prdx1 gene knockdown on the viability of N2a cells induced by OGD/R.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs OGD/Rgroup.圖4 Prdx1敲減對OGD/R誘導的N2a細胞活力的影響

4 Prdx1敲減對OGD/R誘導的N2a細胞JNK/cas?pase-3通路的影響

Western blot結果顯示，與control組比較，OGD/R處理組的Prdx1、p-JNK和cleaved caspase-3蛋白水平均顯著升高（P<0.05）；OGD/R處理后，轉染siNC組的Prdx1、p-JNK與cleaved caspase-3蛋白水平與單純OGD/R處理組比較均無顯著差異，而轉染siPrdx1組的Prdx1蛋白表達顯著降低，同時p-JNK和cleaved caspase-3蛋白水平均進一步升高（P<0.05），表明Prdx1基因敲減進一步促進了OGD/R誘導的N2a細胞中JNK和caspase-3的激活，見圖6。

Figure 5.The effect of Prdx1 gene knockdown on the apoptosis of N2a cells induced by OGD/R.The apoptosis of N2a cells was de?tected by TUNEL assay.The green fluorescence represents the apoptotic N2a cells stained by TUNEL.The blue fluores?cence represents the nuclei of all N2a cells stained with DAPI.The scale bar=50μm.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs OGD/Rgroup.圖5 Prdx1敲減對OGD/R誘導的N2a細胞凋亡的影響

Figure 6.The effect of Prdx1 gene knockdown on JNK/caspase-3 pathway in the N2a cells induced by OGD/R.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs OGD/Rgroup.圖6 Prdx1敲減對OGD/R誘導的N2a細胞JNK/caspase-3通路的影響

5 OGD/R誘導的N2a細胞凋亡與JNK/caspase-3通路的關系

TUNEL熒光染色結果顯示，OGD/R處理后，應用SP600125組凋亡N2a細胞的數目與單純OGD/R處理組比較顯著減少（P<0.05），見圖7A。

Western blot結果顯示，OGD/R處理后，應用SP600125組N2a細胞中p-JNK和cleaved caspase-3蛋白水平與單純OGD/R處理組比較均顯著降低（P<0.05），見圖7B。

6 Prdx1通過JNK/caspase-3通路影響OGD/R誘導的N2a細胞凋亡

TUNEL熒光染色結果顯示，轉染siPrdx1后，與單純OGD/R處理組相比，同時應用SP600125可顯著減少凋亡N2a細胞的數目（P<0.05），見圖8A。

Western blot結果顯示，轉染siPrdx1后，與單純OGD/R處理組相比，同時應用SP600125使p-JNK和cleaved caspase-3蛋白水平均顯著降低（P<0.05），見圖8B。

Figure 7.OGD/R-induced N2a cell apoptosis was mediated by JNK/caspase-3 pathway.A：the apoptosis of N2a cells was detected by TUNEL assay（scale bar=50μm）；B：the protein levels of p-JNK，JNK and cleaved caspase-3 in N2a cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs OGD/Rgroup.圖7 JNK/caspase-3通路介導OGD/R誘導的N2a細胞凋亡

討 論

腦缺血再灌注之后，氧供改善，腦組織內活性氧自由基呈爆發式增長，打破了氧化與抗氧化之間的平衡，對腦組織造成不可逆損傷［8］。活性氧自由基可能通過直接損傷DNA、誘發生物膜脂質過氧化、改變部分關鍵酶的活性以及影響核基因的轉錄表達等多種途徑誘發細胞凋亡。小鼠腦神經母細胞瘤N2a細胞具有神經干細胞特征，有分化為類神經元的潛能，易于轉染且大量表達微管蛋白，常被用作阿爾茲海默癥、神經生長及再生和神經毒性等病理生理機制研究的對象［9］。本研究顯示，氧糖剝奪8 h后復糖復氧24 h處理的N2a細胞活力降低，凋亡數目增多，同時伴隨凋亡執行蛋白cleaved caspase-3表達升高，提示OGD/R模型制備成功。

Prdx1屬于典型2-Cy2 Prdx家族中的一員，在哺乳動物各器官組織中廣泛表達，對維持體內ROS水平發揮著重要的作用，并通過調控蛋白激酶的氧化還原狀態，參與細胞增殖、分化和凋亡等方面的信號轉導過程［10-11］。與Wu等［5］的研究一致，Wang等［12］研究對OGD/R后大鼠大腦星形膠質細胞行蛋白表達分析，結果顯示OGD/R后Prdx1-4表達量均顯著升高。在對大鼠腦出血模型的研究中顯示，血腫周圍腦組織Prdx1表達顯著升高，將腺相關病毒Prdx1表達載體注射到大鼠紋狀體3周后，構建腦出血模型，顯示Prdx1過表達后血腫周圍腦組織Bcl-2/Bax增加，神經細胞凋亡減少，表明Prdx1與細胞凋亡密切相關［13］。本實驗通過轉染siPrdx1，表明抑制Prdx1表達使OGD/R處理后的N2a細胞活力進一步降低，并加劇了細胞凋亡。這些結果提示Prdx1可能對保護OGD/R后的N2a細胞起著重要的作用。本研究進一步探討Prdx1基因敲減促進OGD/R誘導的N2a細胞凋亡的可能機制。

Figure 8.Prdx1 affected OGD/R-induced N2a cell apoptosis through JNK/caspase-3 pathway.A：the apoptosis of N2a cells was de?tected by TUNEL assay（scale bar=50μm）；B：the protein levels of p-JNK，JNK and cleaved caspase-3 in N2a cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs OGD/R group；△P<0.05 vs OGD/R+siPrdx1 group.圖8 Prdx1通過JNK/caspase-3通路影響OGD/R誘導的N2a細胞凋亡

JNK信號通路參與細胞增殖、分化、形態維持、骨架構建、凋亡、DNA損傷修復等多種生物學過程［14］。MCAO和OGD/R損傷條件下均可上調神經元p-JNK與cleaved caspase-3的表達水平［15-16］。本研究同樣檢測到OGD/R處理能夠誘導N2a細胞p-JNK與cleaved caspase-3表達水平升高。Lv等［17］研究表明，在小鼠急性肺損傷模型中，Prdx1基因敲除可通過提高ROS水平加重氧化應激和肺損傷，并激活JNK信號通路。由此，我們推測Prdx1對JNK信號通路存在某種調控關系，本研究結果顯示，Prdx1基因敲減可顯著上調OGD/R處理后N2a細胞中p-JNK與cleaved caspase-3的表達水平，這表明Prdx1基因敲減促進OGD/R誘導的N2a細胞凋亡可能與JNK/caspase-3通路活性進一步激活有關。

SP600125是一種小分子JNK抑制劑，可有效阻斷JNK信號通路的激活［18］。為進一步驗證JNK激活是否為Prdx1基因敲減促進N2a細胞凋亡所必須的，我們應用了SP600125，結果表明，與單獨Prdx1基因敲減組的N2a細胞相比，SP600125處理降低了N2a細胞的凋亡率以及p-JNK與cleaved caspase-3表達水平，這進一步證實Prdx1基因敲減是通過JNK/cas?pase-3通路促進OGD/R誘導N2a細胞凋亡。

綜上所述，本研究表明，Prdx1可通過調控JNK/caspase-3通路影響OGD/R誘導的N2a細胞凋亡。這進一步支持了Prdx1可能作為一種內源性保護因子參與了腦缺血再灌注損傷的病理生理過程。