Caspase-1介導的細胞焦亡對腦出血大鼠神經損傷的影響*

郭亞凈， 任 靜， 劉 寒， 李亭亭， 王 洪

（河北中醫學院中西醫結合學院，河北石家莊050200）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）具有很高的死亡率和致殘率，占所有卒中類型的15%~20%，且其發病人數呈逐年上升趨勢［1］。并且，大多數幸存者會遺留不同程度的神經功能障礙［2］。大量研究表明，血腦屏障破壞、腦水腫、炎癥反應和凝血酶毒性效應等繼發性腦損傷是導致神經功能障礙，造成不良預后的主要原因［3-4］。

胱天蛋白酶1（caspase-1）作為炎癥性半胱天冬酶，介導細胞固有免疫炎癥反應，促進白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18等炎癥因子的成熟與釋放。同時，caspase-1還能使細胞焦亡執行蛋白gasdermin D（GSDMD）發生剪切，并在細胞膜聚集，造成細胞穿孔，引起細胞焦亡［5］。實驗研究顯示，caspase-1介導的炎癥反應和細胞焦亡參與多種神經相關性疾病的發展過程［6-10］。然而，其在ICH后神經損傷中是否起作用仍不十分清楚。

本課題組利用自體非抗凝血注射法制造大鼠ICH模型，采用腦室內注射caspase-1選擇性抑制劑Ac-YVAD-CMK的方法，觀察caspase-1介導的細胞焦亡在ICH后神經損傷中的作用。

材料和方法

1 動物

SPF級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，8~10周齡，體重約250~300 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號為SCXK（京）2016-0006。飼養條件，溫度恒定為（22±1）℃，濕度為（50±20）%，光照條件為晝夜各12 h，自由飲食、水。適應性飼養1周后，開始第1部分實驗。將30只大鼠隨機分為5組（每組6只大鼠）：假手術（sham）組、ICH 12 h組、ICH 24 h組、ICH 48 h組和ICH 72 h組。采用Western blot方法，觀察caspase-1和GSDMD在ICH后的表達及激活情況，選取活化變化最明顯的時間點。根據第1部分實驗結果，采用同樣的造模方式，開始第2部分實驗：54只大鼠隨機平均分為3組（每組18只大鼠）：sham組、ICH組和Ac-YVAD-CMK給藥組（YVAD組），用于觀察Ac-YVAD-CMK的作用。造模過程中未出現動物死亡情況，成功率為100%。動物實驗程序通過河北中醫學院實驗動物倫理委員會批準（編號DWLL-2018005）。

2 主要試劑

Ac-YVAD-CMK購自APExBIO；BCA蛋白濃度測定試劑盒、神經元核抗原（neuronal nuclei，NeuN；神經元特異性核蛋白）抗體、離子鈣結合接頭分子1（ionized calcium-binding adaptor molecule-1，Iba-1；小膠質細胞標志物）抗體和β-actin抗體購自Servicebio；ECL顯色試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；caspase-1和GSDMD抗體購自Santa Cruz；IL-1β和IL-18抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗IgG購自Cell Signaling Technology；TUNEL試劑盒購自Roche；Fluoro-Jade C（FJC）染色劑購自Millipore。

3 主要方法

3.1 Ac-YVAD-CMK給藥方法 給藥方法參考已有文獻［11］。將Ac-YVAD-CMK溶解于DMSO中，用PBS進一步稀釋至濃度為1 g/L（DMSO終濃度<0.2%）待用。大鼠稱重，1%戊巴比妥鈉，100 mL/kg腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉成功后，將其固定于全自動腦立體定位儀上（51700，Stoelting），剪去大鼠頭頂毛發，碘伏消毒，剪開大鼠頭部正中皮膚約1 cm×1 cm，輕輕擦拭掉顱骨表面筋膜及軟組織，定位前囟，然后以前囟作為原點，向后1.0 mm、向右旁開1.5 mm標記為穿刺點，顱鉆垂直向下鉆開一個直徑約1 mm的注射孔，將裝有Ac-YVAD-CMK的微量注射器安裝到電動注射裝置上，垂直向下進針4.5 mm穿刺進入腦室后，以1μL/min的速度注入Ac-YVAD-CMK，每只大鼠注射1μL。注藥完畢后留針3 min，再緩慢退針。sham組和ICH組操作方法同上，以等體積PBS稀釋的DMSO注入側腦室，不注入任何藥物。

3.2 ICH模型的制備 側腦室注射Ac-YVAD-CMK 20 min后，建立ICH模型。以前囟作為原點，向前0.12 mm、向右旁開3.8 mm標記為穿刺點，然后用顱鉆垂直向下鉆開直徑約1 mm的注射孔。碘伏擦拭大鼠尾尖，剪斷尾尖取血，迅速將100μL血液轉移到微量注射器中，將微量注射器安裝到電動注射裝置上，垂直向下進針5.5 mm穿刺進入紋狀體，以10μL/min的速度注入自體非抗凝血，注射結束后停針20 min，然后緩慢退針。最后用骨蠟封閉注射孔，并用手術線縫合切口。

3.3 神經功能評價 （1）前肢放置實驗用于評價大鼠的感覺運動功能：測試者握住大鼠背部皮膚使四肢懸空，將大鼠胡須接觸桌面邊緣誘導其將前肢放置于桌面上，紋狀體受損大鼠，其受損對側肢體將出現不同程度的放置能力缺失。大鼠每側受測10次，左側前肢成功放置的百分率反應損傷情況。（2）轉角實驗用于評價大鼠肢體協調功能：將大鼠放入一個兩塊板所形成的30°夾角內，使其轉身，觀察并記錄大鼠向左側轉身的次數。每只大鼠重復放置10次，每次間隔至少30 s，左側轉身次數百分率反應損傷情況。（3）改良神經功能缺損評分（modified neurologi?cal severity score，mNSS）用于評價大鼠的運動、感覺、平衡和反射功能：評分范圍為0~18分，分值越高，其神經損害越嚴重，評分方法參考相關文獻［12］。

3.4 干濕比重法 用于檢測腦組織含水量，觀察水腫情況。大鼠麻醉后，迅速取腦組織。將其分為病灶側皮質、病灶側基底、病灶對側皮質、病灶對側基底及小腦5個部分。將腦組織分別放入錫紙中，稱量濕重并記錄。然后，將錫紙包裹的腦組織，放入恒溫干燥箱（UF160，Memmert）中，以100℃烘干24 h。將烘烤后的腦組織取出，稱量干重。腦組織含水量（%）=（濕重?干重）/濕重×100%。

3.5 標本的留取和制備 將麻醉成功的大鼠固定于操作臺上，充分暴露大鼠胸腔，在右心耳處做一小切口。自左心室注入冰冷的生理鹽水，將心血管系統內的血液沖洗干凈。腦組織完整取出后去除小腦和腦干，僅留大腦。用于病理學檢測的組織，在血液注射進針點冠狀面將大腦分為前后兩部分，放入4%組織細胞固定液中進行固定，隨后進行蠟塊包埋和組織切片；用于Western blot檢測的組織，以血液注射進針點冠狀面為基準，分別向其前后延伸1 mm距離，切取厚約2 mm的腦組織切片，并留取患側紋狀體腦組織，于液氮中存放24 h后，轉入?80℃冰箱備用。所有操作均在冰上快速進行，以防止蛋白酶降解蛋白。

3.6 HE染色 用于觀察血腫周圍腦組織病理學變化及水腫情況。正置顯微鏡下（DM5300，Leica），每張切片選取4個視野進行拍照，每只動物選取3張切片進行觀察。

3.7 FJC染色 用于檢測血腫周圍神經元退化情況。石蠟腦組織切片脫蠟至水后，用PBS沖洗，每次5 min，沖洗3次后將切片浸入0.06%的髙錳酸鉀溶液中10 min（在搖床上輕搖）。從高錳酸鉀溶液中取出切片，PBS沖洗3次，每次5 min。在避光環境下，將切片轉移浸入0.000 1%的FJC染色液中染色30 min。用蒸餾水沖洗3次，每次5 min，切片周圍水用紙巾擦干，晾干5 min，烤箱中（50℃）烘烤5 min。然后，將干燥后的切片置于二甲苯中進行透明，用抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下（DM5300，Lei?ca），每張切片選取血腫周圍組織4個視野進行拍照，并用ImageJ軟件進行FJC陽性細胞數量統計。

3.8 Western blot 用RIPA裂解液進行腦組織勻漿后，在4℃下，12 000×g離心15 min。然后收集上清液，使用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。將含有50μg蛋白質的上清液加入SDS-PAGE分離，然后將分離的蛋白質轉移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉PVDF膜后，分別孵育caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18和β-actin抗體，于4℃過夜。然后，將TBST洗滌后的PVDF膜孵育過氧化物辣根酶標記的Ⅱ抗，于室溫下放置90 min。使用ECL顯色試劑盒進行顯影，多功能激光掃描系統（Fusion FX5 Spectra，Vil?ber）檢測蛋白含量，ImageJ軟件進行灰度分析。

3.9 免疫熒光雙標染色 石蠟切片脫蠟至水，稍甩干后用3%H2O2處理切片10 min，抑制內源性過氧化酶的活性，PBS漂洗3次，每次5 min。放入枸櫞酸鹽緩沖液中加熱修復抗原10 min，室溫冷卻，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加羊血清，于37℃恒溫箱中封閉1 h；輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加鼠源和兔源Ⅰ抗（GSDMD和Iba-1抗體，或GSDMD和NeuN抗體），于濕盒內4℃孵育過夜；次日用PBS漂洗3次，每次5 min。切片滴加兩種相應種屬的熒光Ⅱ抗，避光室溫孵育30 min。PBS中漂洗3次后，滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。PBS中漂洗3次，抗熒光淬滅封片劑封片。正置熒光顯微鏡下（DM5300，Leica），觀察并采集圖像，用ImageJ軟件進行分析。

3.10 免疫熒光與TUNEL雙染 TUNEL（綠色）和Iba-1（紅色）雙染色用于評估ICH后小膠質細胞焦亡情況。石蠟切片經脫蠟至水、抑制內源性過氧化酶、抗原修復步驟后，根據TUNEL檢測試劑盒（Roche）說明書，進行TUNEL染色；然后往切片上加入Iba-1抗體，4℃孵育過夜；次日將切片與熒光染料標記的Ⅱ抗在室溫黑暗環境中孵育2 h；最后DAPI染核，抗熒光淬滅封片劑封片。在正置熒光顯微鏡下進行觀察和拍照，每個切片在血腫周圍選取3個視野，每個腦組織選取3個切片進行觀察。使用ImageJ軟件分析TUNEL陽性小膠質細胞數量。

4 統計學處理

用GraphPad Prism 7軟件進行統計分析。數據均采用均數±標準誤（mean±SEM）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用Tukey's檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 ICH后患側紋狀體中caspase-1和GSDMD蛋白的表達及激活情況

Western blot結果顯示，與sham組比較，caspase-1、pro-caspase-1、caspase-1/pro-caspase-1、GSDMD-N、GSDMD和GSDMD-N/GSDMD均在ICH后72 h時顯著升高（P<0.05），并且在72 h時病變最為明顯，見圖1。因此，本課題組選擇ICH 72 h時點作為后續實驗時點。

Figure 1.Western blot results for the changes of caspase-1（A）and GSDMD（B）activation and expression in the perihematoma after intracerebral hemorrhage（ICH）.Mean±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs sham group.圖1 腦出血后血腫周圍組織caspase-1和GSDMD的激活及蛋白表達

2 抑制caspase-1對ICH大鼠神經功能的影響

前肢放置實驗結果顯示，與sham組比較，ICH大鼠左側前肢放置成功率顯著下降（P<0.01），而抑制caspase-1顯著提高了大鼠左側前肢放置成功率（P<0.05），見圖2A。轉角實驗結果顯示，與sham組比較，ICH大鼠左側轉身的百分比顯著下降（P<0.05），而抑制caspase-1顯著提高了大鼠左側轉身的百分比（P<0.05），見圖2B。mNSS結果顯示，與sham組比較，ICH大鼠mNSS顯著升高（P<0.01），而抑制caspase-1顯著降低了大鼠mNSS（P<0.05），見圖2C。

Figure 2.Neurological function assessment in the rats with intracerebral hemorrhage（ICH）.A：forelimb placement test；B：corner turn test；C：modified neurological severity score（mNSS）.Mean±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs sham group；#P<0.05 vs ICH group.圖2 腦出血大鼠的神經功能評估結果

3 抑制caspase-1對ICH大鼠神經損傷的影響

HE染色結果顯示，sham組大鼠腦組織中神經細胞排列整齊、分布勻稱，細胞組織結構染色均勻；ICH組大鼠血腫周圍腦組織中小膠質細胞數量增加，神經細胞腫脹，排布不均，部分細胞固縮性壞死，染色加深；YVAD組大鼠血腫周圍腦組織中神經細胞腫脹明顯減輕，固縮壞死細胞數量減少，見圖3A。干濕比重結果顯示，與sham組比較，ICH大鼠病灶側基底顯著水腫（P<0.05），而抑制caspase-1顯著緩解了病灶側基底的水腫（P<0.05），見圖3B。然而，與sham組比較，ICH大鼠病灶側皮質、病灶對側基底、病灶對側皮質及小腦的水腫情況無顯著差異。FJC染色結果顯示，與sham組比較，ICH大鼠血腫周圍腦組織中FJC染色陽性細胞數量顯著增加（P<0.05），而抑制caspase-1顯著減少了FJC染色陽性細胞的數量（P<0.05），見圖3C、D。

Figure 3.Nerve injury in the rats with intracerebral hemorrhage（ICH）.A：HE staining was used to observe the histopathological changes in the surrounding tissues of hematoma（scale bar=50μm）；B：the changes of brain water content in different parts of brain tissue（Ispi：ispilateral；Cont：contralateral；BG：basal ganglia；CX：cortex）in each group；C：representa?tive microphotographs and quantitative analysis of Fluoro-Jade C（FJC）-positive neurons in the surrounding tissues of hema?toma（scale bar=50μm）；D：representative image of the surrounding tissues of hematoma.Mean±SEM.n=6.*P<0.05 vs shamgroup；#P<0.05 vs ICH group.圖3 腦出血大鼠神經損傷情況

4 抑制caspase-1對ICH大鼠患側紋狀體中cas?pase-1和GSDMD蛋白表達及激活的影響

Western blot結果顯示，與sham組比較，ICH大鼠腦組織中caspase-1、pro-caspase-1、caspase-1/pro-cas?pase-1、GSDMD-N、GSDMD和GSDMD-N/GSDMD均顯著升高（P<0.05），而抑制caspase-1顯著降低了上述蛋白的表達及激活水平（P<0.05），見圖4。

5 抑制caspase-1對ICH大鼠血腫周圍腦組織中TUNEL和GSDMD陽性神經元和小膠質細胞的影響

免疫熒光雙標結果顯示，與sham組比較，ICH大鼠血腫周圍腦組織中GSDMD陽性表達小膠質細胞的數量顯著增加（P<0.01），而抑制caspase-1顯著減少了GSDMD陽性表達小膠質細胞的數量（P<0.01），見圖5A。免疫熒光與TUNEL共染色結果顯示，與sham組比較，ICH大鼠血腫周圍腦組織中TUNEL陽性小膠質細胞的數量顯著增加（P<0.01），而抑制caspase-1顯著減少了TUNEL陽性小膠質細胞的數量（P<0.05），見圖5B。免疫熒光雙標結果顯示，ICH組大鼠血腫周圍腦組織中GSDMD陽性表達神經元數量與sham組比較無顯著差異，見圖5C。

6 抑制caspase-1對ICH大鼠患側紋狀體中IL-1β和IL-18蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與sham組比較，ICH大鼠腦組織中IL-1β和IL-18蛋白表達顯著升高（P<0.05），而抑制caspase-1顯著降低了IL-1β和IL-18的表達（P<0.05），見圖6。

Figure 4.Western blot results showed that Ac-YVAD-CMK inhibited the activation and protein expression of caspase-1（A）and GSDMD（B）.Mean±SEM.n=6.*P<0.05 vs shamgroup；#P<0.05 vs ICH group.圖4 Ac-YVAD-CMK抑制caspase-1和GSDMD的激活及蛋白表達

討 論

1 由caspase-1介導的細胞焦亡在ICH后神經損傷中發揮重要作用

細胞焦亡是一種炎癥程序性細胞死亡方式，兼具凋亡和壞死的特征［13］。焦亡細胞病理表現為核固縮，DNA斷裂，TUNEL染色為陽性，但胞體增大，胞膜完整性被破壞，胞膜上形成1~2 nm的膜孔［5］。GSDMD是細胞焦亡的效應蛋白，屬于gasdermin家族。GSDMD被激活的caspase剪切，釋放N末端與細胞膜的脂質融合，形成膜孔，改變細胞的滲透壓，破壞細胞膜的功能，使得細胞膜破裂，導致細胞焦亡［14］。

焦亡途徑包括caspase-11或caspase-4/5介導的非經典焦亡途徑和caspase-1介導的經典焦亡途徑。在刺激信號作用下，pro-caspase-1被招募到炎癥小體后二聚體化，激活其自身的蛋白酶活性，自剪切形成具有催化活性的caspase-1，caspase-1切割pro-IL-1β和pro-IL-18，使其活化成為有活性的IL-1β和IL-18，活化后的炎癥因子通過GSDMD形成的膜孔釋放至細胞外，募集更多的炎癥細胞聚集，擴大炎癥反應［15-16］。研究結果顯示，ICH大鼠患側紋狀體中cas?pase-1和GSDMD的表達及活化在72 h內逐漸升高，表明ICH大鼠腦組織中出現了細胞焦亡。

Ac-YVAD-CMK是一種caspase-1選擇性抑制劑，有研究顯示其可以改善膠原酶誘導的ICH小鼠或大鼠的神經功能障礙和caspase-1介導的炎癥反應［11，17］。為了進一步證實caspase-1介導的細胞焦亡對ICH后神經損傷的影響，我們在制備ICH模型前，將Ac-YVAD-CMK注入側腦室，觀察其對大鼠神經損傷和神經功能的作用。結果顯示，Ac-YVAD-CMK顯著改善了大鼠的神經功能障礙、組織病理學變化和腦組織水腫，減少了退行性神經元的數量，說明抑制caspase-1顯著地改善了ICH大鼠的神經功能障礙和神經損傷，與其他學者的研究結果一致。同時，Ac-YVAD-CMK顯著降低了ICH大鼠患側紋狀體內caspase-1和GSDMD的表達及激活水平，降低了IL-1β和IL-18的表達水平，說明抑制caspase-1顯著抑制了ICH大鼠腦組織中的細胞焦亡。這些結果表明，caspase-1介導的細胞焦亡在ICH大鼠的神經損傷和神經功能障礙中發揮重要作用。

2 ICH后激活的小膠質細胞內發生caspase-1介導的細胞焦亡

小膠質細胞是中樞神經系統內特有的固有免疫細胞，約占腦內所有細胞總數的5%~10%［18］。當中樞神經系統受到損害時，小膠質細胞數分鐘即被激活，并遷移到損傷部位［19-20］。激活后的小膠質細胞存在M1和M2兩種狀態：M1狀態下的小膠質細胞主要作用為釋放多種促炎因子來加強炎癥反應，例如IL-1β、IL-18和MCP-1等［21］，M2狀態下的小膠質細胞主要作用則為抑制炎癥反應［22-23］。當小膠質細胞被過度活化，其釋放大量的促炎細胞因子、趨化因子和氧化代謝物等會加劇神經損傷［24］。有研究顯示，ICH發生后數分鐘內小膠質細胞即被激活，且主要表現為M1型，產生IL-6和TNF-α等細胞因子，促進炎癥反應，加重腦組織損傷［25］。雖然我們的研究結果顯示，ICH大鼠腦組織中發生caspase-1介導的炎癥反應和細胞焦亡，但焦亡發生在小膠質細胞內還是神經元內仍不清楚。為了進一步進行驗證，我們采用免疫熒光雙標和免疫熒光與TUNEL共染色的方法進行觀察。結果顯示，ICH大鼠血腫周圍腦組織中GSDMD和TUNEL陽性小膠質細胞數量顯著增加，Ac-YVAD-CMK可以顯著減少GSDMD和TUNEL陽性小膠質細胞的數量。然而，對照組與ICH組大鼠血腫周圍腦組織中GSDMD陽性神經元的數量無顯著差異。這些結果說明ICH大鼠腦組織中caspase-1介導的細胞焦亡主要發生在小膠質細胞內。

Figure 5.The results of double immunofluorescence labeling and co-staining of immunofluorescence and TUNEL.A：representative microphotographs and quantitative analysis of GSDMD-positive microglia in the surrounding tissues of hematoma；B：repre?sentative microphotographs and quantitative analysis of TUNEL-positive microglia in the surrounding tissues of hematoma；C：representative microphotographs and quantitative analysis of GSDMD-positive neurons in the surrounding tissues of he?matoma.The scale bar=50μm.Mean±SEM.n=6.**P<0.01 vs sham group；#P<0.05，##P<0.01 vs ICH group.圖5 免疫熒光雙標和免疫熒光與TUNEL共染色結果

Figure 6.Western blot results showed that Ac-YVAD-CMK in?hibited the expression of IL-1β（A）and IL-18（B）.Mean±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs sham group；#P<0.05 vs ICH group.圖6 Ac-YVAD-CMK抑制IL-1β和IL-18蛋白表達

綜上所述，大鼠ICH發生后，小膠質細胞被激活，發生caspase-1介導的炎癥反應和細胞焦亡，釋放大量炎癥因子，造成周圍神經元退化，導致神經損傷和神經功能障礙。然而，造成小膠質細胞激活和神經元退化的機制仍有待進一步研究。