TRPC6介導(dǎo)的鈣離子紊亂通過激活STAT3促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞損傷后炎癥反應(yīng)及腎間質(zhì)纖維化*

練飛鴻， 付 榮， 王雯倩， 彭 璇△

（1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東廣州510260）

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）的發(fā)病率逐年升高，已成為全世界重要的公共衛(wèi)生問題，而腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是各種腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎衰竭的主要病理基礎(chǔ)和最終結(jié)局。RIF的機(jī)制錯綜復(fù)雜，涉及到多細(xì)胞、多因素、多途徑的共同作用及交互影響［1-2］。研究表明，腎小管上皮細(xì)胞（tubular epithelial cells，TECs）在致病因素的作用下極易受到損傷，發(fā)生結(jié)構(gòu)及功能的異常。受損的TECs停滯于細(xì)胞周期G2/M期，合成、釋放大量的炎癥因子及促纖維化因子，加強(qiáng)免疫細(xì)胞遷移和浸潤，使炎癥反應(yīng)持續(xù)放大。釋放的細(xì)胞因子可正反饋作用于TECs自身，促進(jìn)腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和TECs的繼發(fā)性損傷，促進(jìn)腎臟的炎癥反應(yīng)及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化。此外，受損的TECs存在代謝紊亂、線粒體功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致活性氧類釋放增多，促進(jìn)纖維化的發(fā)生發(fā)展［3-7］。

鈣離子（Ca2+）是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與了細(xì)胞收縮舒張、增殖分化、遞質(zhì)釋放及死亡等多種生命活動的調(diào)節(jié)。在真核生物體內(nèi)，細(xì)胞通過一系列復(fù)雜而嚴(yán)密的機(jī)制對Ca2+濃度進(jìn)行調(diào)控。其中，鈣池操控性鈣通道（store-operated calcium channel，SOC）是調(diào)節(jié)非興奮細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的主要通道，保證信號的正常傳遞。瞬時受體電位陽離子通道C亞族（tran?sient receptor potential cation channel subfamily C，TRPC）是構(gòu)成細(xì)胞膜上SOC的分子基礎(chǔ)，該家族包括了TRPC1~7共7個成員，而越來越多的研究顯示TRPC6參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能由于TRPC6基因啟動子區(qū)域含有活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）反應(yīng)元件，參與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的持續(xù)增高，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+紊亂，進(jìn)而引起下游疾病相關(guān)靶基因的活化［8］。

近年來，越來越多的研究證實TRPC6與腎小球疾病的發(fā)病密切相關(guān)，足細(xì)胞TRPC6基因突變與家族性局灶節(jié)段性腎小球硬化癥（focal segmental glor?nurular sclerosis，F(xiàn)SGS）相關(guān)，同時帶有該突變基因的患者較快進(jìn)展至終末期腎病，盡管其機(jī)制尚不明確，但一定程度上提示我們可能與TRPC6介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+紊亂相關(guān)［9］。既往對TRPC6介導(dǎo)Ca2+的研究多集中于腎小球病變上，其對小管間質(zhì)損傷的作用及調(diào)控機(jī)制還所知甚少。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路活化參與了細(xì)胞多種病理生理過程。作為STAT家族的重要成員，STAT3的活化在細(xì)胞增殖、遷移、分化以及炎癥/免疫反應(yīng)疾病的發(fā)病過程發(fā)揮重要作用。既往研究證實，STAT3磷酸化與腫瘤以及組織纖維化所致的慢性疾病密切相關(guān)，參與了腎間質(zhì)纖維化的啟動和維持［10-12］。

本研究利用藥物抑制TRPC6介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，建立小鼠單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteric obstruc?tion，UUO）［13］模型，觀察原代TECs內(nèi)Ca2+濃度變化及腎小管損傷程度、腎組織炎癥細(xì)胞浸潤、炎癥因子水平及腎臟纖維化情況。體外實驗通過上調(diào)/沉默HK-2細(xì)胞TRPC6，研究TGF-β刺激下TECs炎癥因子的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，探討其在TECs損傷后炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制。

材料和方法

1 實驗動物及實驗細(xì)胞

雄性SPF級C57BL/6小鼠，8周齡，體重22~25 g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，許可證號為SCXK（粵）2013-0034。所有實驗動物均于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院SPF級實驗動物房飼養(yǎng)和繁殖，所有研究工作均遵循廣州醫(yī)科大學(xué)《實驗動物管理及使用指南》，并由廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理委員會批準(zhǔn)（審查編號B2019-050）。HK-2細(xì)胞（人腎臟近曲小管上皮細(xì)胞）購于ATCC。

2 主要試劑

BTP2和BATPA（Sigma）；抗TRPC6、STAT3和p-STAT3Ⅰ抗（Abcam）；抗COL1Ⅰ抗（Cell Signaling Technology）；抗β-actinⅠ抗（Invitrogen）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Invitrogen）；封閉牛奶和loading buffer（Bio-Rad）；PVDF膜（Millipone）；Fluo-4 AM（Thermo Fisher Scientific）。

3 主要方法

3.1 小鼠UUO模型的建立 UUO為經(jīng)典的腎臟纖維化模型，可以在較短時間內(nèi)導(dǎo)致動物梗阻測腎臟發(fā)生腎間質(zhì)纖維化。本研究選擇體重位于22~25 g的雄性C57BL/6小鼠24只，8周齡，隨機(jī)分為4組：假手術(shù)+溶媒組（sham+vehicle），sham+BTP2組，UUO+vehicle組和UUO+BTP2組，每組6只。以1%戊巴比妥麻醉小鼠，仰臥位固定于小鼠板，對小鼠腹部進(jìn)行消毒，切開左側(cè)腹部暴露并分離左側(cè)輸尿管，以絲線靠近腎門端及靠近膀胱端雙結(jié)扎左側(cè)輸尿管，逐層縫合腹膜及皮膚。Sham組打開腹腔后不結(jié)扎輸尿管，余操作與手術(shù)組相同。術(shù)后給予常規(guī)飼料及飲用水，于術(shù)后14 d以頸椎脫臼法處死小鼠，獲取腎臟。一部分用于石蠟包埋及切片，行病理染色觀察，另一部分置于液氮冷凍后轉(zhuǎn)移至?80℃冰箱保存，用于組織蛋白及核酸的提取。

3.2 小鼠原代腎上皮細(xì)胞分離 將假手術(shù)組和UUO組小鼠斷頸處死，無菌獲取雙腎，用0.01 mol/L PBS液反復(fù)沖洗雙腎；去除腎包膜，用無菌剪刀將腎皮質(zhì)剪碎，吸入15 mL離心管，加入PBS反復(fù)多次以清洗組織碎片；離心，去上清，向組織內(nèi)加入溶解于鈣鎂平衡鹽溶液中的0.25%胰蛋白酶，37℃振蕩消化30 min；輕輕吹打分散組織；將組織碎片轉(zhuǎn)移到100目無菌不銹鋼絲網(wǎng)上充分研磨，收集液體至200目鋼絲網(wǎng)過濾，離心10 min，棄上清，加入45%Per?coll分離液25 mL重懸細(xì)胞；4℃、28 347×g離心30 min，取近管底的F2層，即為分離純化的近端腎小管細(xì)胞節(jié)段，用生理鹽水離心洗滌2次，離心5 min，將細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)，通過細(xì)胞免疫熒光觀察細(xì)胞CK-18及E-cadherin表達(dá)，對腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

3.3 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度測定 用鈣的熒光指示劑Fluo-4/AM孵育細(xì)胞30 min；加入含有1%胎牛血清的HBSS孵育40 min后用HEPES液洗滌、重懸細(xì)胞，制成約1×108/L的溶液，37℃下培養(yǎng)10 min；于激光共聚焦顯微鏡專用皿中觀察，按［Ca2+］i=Kd×（F?Fmin）/（Fmax?F）將熒光信號值換算成細(xì)胞內(nèi)鈣的濃度（nmol/L），其中37℃條件下的Kd值為450 nmol/L。

3.4 Western blot 取小鼠腎組織或HK-2細(xì)胞于RIPA裂解液中裂解，超聲粉碎30 s；離心15 min后取上清液，使用Bradford蛋白定量法測定蛋白濃度。各樣品配至終濃度為2 g/L，加入4×SDS上樣緩沖液后沸水水浴使蛋白變性。總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離、電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，加入Ⅰ抗4℃孵育過夜，次日加入Ⅱ抗孵育，化學(xué)發(fā)光顯影。

3.5 real-time PCR 通過基因庫（GenBank；http：//www.ncbi.nlm.nkh.gov/pubmed/fulltext.htlm）獲得PCR引物的基因序列，通過Primer Premier 5.0軟件完成引物設(shè)計。反應(yīng)條件為：95℃30 s；95℃15 s，60℃30 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。每個樣品測3個復(fù)孔，分析樣品的擴(kuò)增曲線及熔解曲線，其中ΔCt=Ct目的基因?Ct內(nèi)參照，ΔΔCt=ΔCt實驗組?ΔCt對照組，計算出樣品定量結(jié)果的平均值。

3.6 細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HK-2細(xì)胞在37℃無菌環(huán)境、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。使用Lipofecta?mineTM2000進(jìn)行TRPC6質(zhì)粒及TRPC6siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率鑒定通過Western blot檢測相應(yīng)蛋白的表達(dá)實現(xiàn)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 梗阻型腎病模型中TECs內(nèi)Ca2+濃度增加且伴隨TRPC6表達(dá)升高

以C57BL/6小鼠為研究對象，建立UUO模型誘導(dǎo)腎臟纖維化，分離鑒定原代腎小管上皮細(xì)胞（圖1A），使用激光共聚焦技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，如圖1B所示，與對照組相比，UUO模型組TECs中Ca2+濃度顯著增加。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，梗阻側(cè)腎臟小管上皮細(xì)胞TRPC6表達(dá)水平增高，伴隨COL1表達(dá)增多（P<0.05），見圖1C。

2 TRPC6抑制劑減輕UUO模型小鼠腎臟炎癥反應(yīng)及纖維化水平

通過向小鼠腹腔注射BTP2抑制TRPC6通道的活性后觀察其對腎臟炎癥反應(yīng)及腎間質(zhì)纖維化的影響。HE染色結(jié)果顯示，注射溶媒及BTP2的假手術(shù)組小鼠腎組織均未見顯著異常；UUO模型小鼠中，注射溶媒后小鼠腎小管顯著擴(kuò)張，TECs細(xì)胞扁平，小管間質(zhì)增寬，伴大量炎癥細(xì)胞浸潤，而注射BTP2則可減輕腎臟上述病理改變，見圖2A。進(jìn)一步檢測了小鼠腎組織IL-1β、IL-6及TNF-α3種主要促炎因子的mRNA水平。Real-time PCR結(jié)果顯示，與sham組相比，UUO模型組小鼠腎組織IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA水平顯著升高（P<0.05），BTP2可抑制UUO模型小鼠腎組織IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)（P<0.05），見圖2B。此外，Masson病理染色結(jié)果顯示，與溶酶模型組比，BTP2干預(yù)減少了間質(zhì)膠原沉積，減輕了腎間質(zhì)纖維化程度，見圖3A。Western blot結(jié)果亦顯示，BTP2干預(yù)可降低腎組織COL1的蛋白水平，結(jié)果與染色結(jié)果類似，見圖3B。

Figure 1.Increasing TECs Ca2+concentration in obstructive nephropathy model was accompanied by increased expression of TRPC6.A：mouse TECs were isolated and cultured and stained with CK-18 and E-cadherin（scale bar=20μm）；B：Ca2+concentra?tion was detected in mice primary TECs subjected to either sham operation or UUOoperation；C：kidney tissue lysates were subjected to immunoblot analysis for TRPC6 and COL1.Mean±SEM.n=6.*P<0.05 vs shamgroup.圖1 梗阻性腎病模型中TECs中Ca2+濃度增加伴隨TRPC6表達(dá)增多

Figure 2.Pharmalogical inhibition of TRPC6 reduced inflammation in UUOmodel mice.A：representative HEstaining images of kid?ney histology showed the morphologic injury and inflammatory cells infiltration and BTP2 injection reduced inflammation caused by obstraction（scale bar=20μm）；B：the mRNA expression of IL-1β，IL-6 and TNF-αwas determined by realtime PCR.Mean±SEM.n=6.*P<0.05 vs sham+vehicle group；#P<0.05 vs UUO+vehicle group.圖2 BTP2抑制TRPC6減輕UUO模型小鼠腎臟組織炎癥反應(yīng)

Figure 3.Drug inhibition of TRPC6 reduced renal interstitial fibrosis in UUO model mice.A：representative Masson staining images of kidney histology（scale bar=20μm）；B：Western blot analysis of proteins in different groups as indicated.Mean±SEM.n=6.*P<0.05 vs sham+vehicle group；#P<0.05 vs UUO+vehicle group.圖3 BTP2抑制TRPC6減輕UUO模型小鼠腎間質(zhì)纖維化

3 上調(diào)TRPC6加重TGF-β作用下HK-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞外基質(zhì)的合成

由于BTP2除了抑制TRPC6通道外，對其他SOC通道也存在一定作用，為了明確TRPC6對腎小管上皮細(xì)胞損傷后炎癥反應(yīng)及細(xì)胞外基質(zhì)合成的影響，我們向HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRPC6質(zhì)粒誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)，如圖4A，與空載體（vector）組相比，轉(zhuǎn)染TRPC6質(zhì)粒進(jìn)一步加重了TGF-β刺激下小管上皮細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α 的mRNA表 達(dá)（P<0.05）；Western blot結(jié)果顯示，與空載體組相比，細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRPC6質(zhì)粒后，TRPC6蛋白的表達(dá)增加，同時伴隨COL1的表達(dá)水平升高，見圖4B。

Figure 4.Overexpression of TRPC6 aggravated TGF-β-induced inflammatory response and extracellular matrix synthesis.A：HK-2 cells were transiently transfected with pcDNA3.1-TRPC6 or pcDNA3.1-HA（empty vector）and challenged with TGF-β，and the mRNA expression of IL-1β，IL-6 and TNF-αwas determined by real-time PCR；B：cell lysates were analyzed by immunoblotting with the indicated antibodies.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs vector group；#P<0.05 vs TGF-β+vector group.圖4 上調(diào)TRPC6加重TGF-β誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞外基質(zhì)的合成

4 沉默TRPC6抑制TGF-β誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞外基質(zhì)的合成

通過向HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRPC6siRNA抑制TRPC6表達(dá)，結(jié)果顯示，在TGF-β刺激下，HK-2細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA水平較轉(zhuǎn)染scramble siRNA組下調(diào)（P<0.05），見圖5A。Western blot結(jié)果顯示，與scramble siRNA組相比，細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRPC6siRNA后，TRPC6蛋白的表達(dá)受到抑制，同時在TGF-β刺激下，HK-2細(xì)胞COL1的表達(dá)水平下降，見圖5B。

Figure 5.Silencing of TRPC6 alleviated TGF-β-induced inflammation and extracellular matrix synthesis.A：the mRNA expression of IL-1β，IL-6 and TNF-αwas determined by real-time PCR；B：the protein expression of TRPC6 and COL1 was detected by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs scramble group；#P<0.05 vs TGF-β+scramble group.圖5 沉默TRPC6減輕TGF-β誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞外基質(zhì)合成

5 沉默TRPC6減弱了TGF-β作用下HK-2細(xì)胞STAT3的活化

在UUO模型中檢測到STAT信號通路的活化，表現(xiàn)為腎組織p-STAT3表達(dá)較sham組增多，而注射BTP2后，p-STAT3水平較溶媒組下降（P<0.05），見圖6A。體外實驗中，Western blot結(jié)果顯示，TGF-β刺激下，腎小管上皮細(xì)胞STAT3磷酸化水平增加，細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRPC6siRNA后，STAT3磷酸化水平顯著下降（P<0.05），見圖6B。

6 高表達(dá)TRPC6進(jìn)一步促進(jìn)TGF-β作用下HK-2細(xì)胞STAT3活化

向HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRPC6質(zhì)粒抑制后檢測STAT信號通路活化的情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TRPC6質(zhì)粒進(jìn)一步促進(jìn)HK-2細(xì)胞中TGF-β誘導(dǎo)的p-STAT3表達(dá)，而使用鈣離子螯合劑BATPA后，p-STAT3表達(dá)被明顯抑制，蛋白水平顯著降低，見圖7。

討 論

腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜，涉及到多因素、多細(xì)胞、多途徑的作用，其特征表現(xiàn)為大量細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積，造成腎實質(zhì)的纖維化，最終導(dǎo)致腎功能的喪失［14］。在致病因素的作用下，腎臟發(fā)生炎癥反應(yīng)以清除病原體、修復(fù)組織損傷，但級聯(lián)的炎癥反應(yīng)也是腎間質(zhì)纖維化的始動因素。TECs是腎實質(zhì)主要的固有細(xì)胞之一，正常情況下，TECs代謝旺盛，擔(dān)負(fù)著重吸收與分泌的功能，具有潛在的增殖及再生能力。越來越多的研究表明，TECs不僅是腎臟病變過程中的“受害者”，更主動參與了腎臟纖維化的形成。受損的TECs停滯于細(xì)胞周期的G2/M期，合成、釋放大量的炎癥因子及促纖維化因子，這些細(xì)胞因子加強(qiáng)免疫細(xì)胞遷移和浸潤，使炎癥反應(yīng)持續(xù)和放大，而釋放的細(xì)胞因子可正反饋作用于TECs自身，促進(jìn)EMT和TECs的繼發(fā)性損傷，促進(jìn)腎臟的炎癥反應(yīng)及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化［15］。我們的研究也顯示，在UUO模型中，腎組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為大量炎癥細(xì)胞的浸潤以及炎癥因子合成增多，伴隨腎間質(zhì)纖維化程度較假手術(shù)組顯著加重。但病理狀態(tài)下，TECs損傷后生物學(xué)行為改變和炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不清楚。

Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與了細(xì)胞多種生命活動的調(diào)節(jié)。在真核生物體內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高主要來源于細(xì)胞外鈣內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣庫的釋放，而外鈣內(nèi)流途徑主要通過受體門控性鈣通道（re?ceptor-operated calcium channel，ROC）、電壓門控鈣通道（voltage-operated calcium channel，VOC）和SOC的調(diào)控。在受到相應(yīng)刺激時，ROC和VOC通道開放，使大量Ca2+短時間內(nèi)流入細(xì)胞內(nèi)，而SOC則持續(xù)產(chǎn)生小量的鈣內(nèi)流，以保證信號的正常傳遞。TRPC是構(gòu)成細(xì)胞膜上ROC和SOC的分子基礎(chǔ)。而越來越多的研究顯示TRPC6參與了心血管疾病、腫瘤、呼吸系統(tǒng)等多種疾病的發(fā)生發(fā)展［8，16-17］。

Figure 6.Inhibition of TRPC6 reduced renal tissue STAT3 activation.A：representative immunoblot analysis of STAT3 and p-STAT3 in UUOmouse kidney extracts；B：relative protein levels of p-STAT3 in HK-2 cells.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs sham+vehicle group；#P<0.05 vs UUO+vehicle group；△P<0.05 vs scramble group；▲P<0.05 vs TGF-β+scramble group.圖6 抑制TRPC6可抑制腎組織及HK-2細(xì)胞中STAT3活化

Figure 7.Overexpression of TRPC6 promoted STAT3 activation in HK-2 cells.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs TGF-β+vector group；#P<0.05 vs TGF-β+TRPC6 plasmid group.圖7高表達(dá)TRPC6促進(jìn)HK-2細(xì)胞STAT3活化

近年來，關(guān)于TRPC6與腎臟疾病的研究取得了顯著進(jìn)展，主要涉及足細(xì)胞。該基因突變可導(dǎo)致大量蛋白尿。人類全基因組關(guān)聯(lián)研究從基因水平證明，足細(xì)胞Trpc6基因突變與家族性局灶節(jié)段性腎小球硬化癥相關(guān)，同時帶有該突變基因患者較快進(jìn)展至終末期腎病［9］。血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓腎病模型中，TRPC6基因敲除小鼠蛋白尿顯著減少，腎功能水平及腎臟病理改變水平顯著優(yōu)于野生型對照組，并且這種保護(hù)作用獨立于血流動力的改變［18］。既往對TRPC6的研究多集中于腎小球病變上，其對小管間質(zhì)損傷所致纖維化的作用及調(diào)控機(jī)制還所知甚少。我們分離UUO模型及假手術(shù)組小鼠原代TECs，顯示UUO模型組TECs內(nèi)Ca2+濃度較對照組顯著升高，同時伴隨TRPC6蛋白表達(dá)水平增高，而藥物抑制TRPC6后腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)及纖維化程度得到改善。我們在體外實驗中也得到相似的結(jié)果，表現(xiàn)為沉默TRPC6表達(dá)減輕TGF-β誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生，而高表達(dá)TRPC6則加重上述反應(yīng)，提示在損傷因素的作用下，TECs發(fā)生Ca2+紊亂，引起腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞外基質(zhì)沉積，而Ca2+紊亂可能由TRPC6通道介導(dǎo)。

STAT蛋白家族與機(jī)體的炎癥及免疫反應(yīng)密切相關(guān)，其中STAT3作為一種轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控多種炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，在細(xì)胞因子合成與釋放過程中起著重要作用，參與多種免疫炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展［19-21］。我們的研究觀察到，在UUO模型小鼠腎組織中STAT3活化，表現(xiàn)為p-STAT3表達(dá)水平增高，同樣，在細(xì)胞實驗中也觀察到類似的現(xiàn)象，而通過藥物抑制或基因沉默TRPC6表達(dá)時，p-STAT3表達(dá)受到抑制，高表達(dá)TRPC6則促進(jìn)p-STAT3的表達(dá)，而使用鈣離子螯合劑處理HK-2細(xì)胞后，p-STAT3的表達(dá)受到抑制，提示TRPC6可能通過影響Ca2+水平調(diào)控TECs STAT3通路，從而促進(jìn)腎臟炎癥反應(yīng)及腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展，

綜上所述，在梗阻性腎病模型及體外應(yīng)用TGF-β刺激下，TECs的TRPC6通道活化可引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，進(jìn)一步激活STAT3通路，引起腎臟的炎癥反應(yīng)及腎間質(zhì)纖維化。