EGFR、ALK、ROS-1基因在肺癌組織中表達及對預后的評估價值

田田 張志紅 崔亞云 (安徽省腫瘤醫院 呼吸腫瘤內科，安徽 合肥 3003；放療科)

非小細胞肺癌(NSCLC)主要包括肺鱗癌、腺癌、大細胞未分化癌，目前臨床治療方式以手術治療為主，并輔助放化療。由于癌癥早期無顯著性病癥，影像學表現也不顯著，導致診斷、治療不及時，一旦確診大部分已步入中晚期，甚至已經發生腦部轉移，嚴重影響患者預后〔1〕。針對激酶靶點的替尼類抑制劑(吉非替尼、厄洛替尼、克唑替尼等)已在臨床廣泛應用，通過檢測患者基因突變類型，指導醫生個體化用藥，可有效提高晚期NSCLC的治療效率〔2〕。與NSCLC相關的常見突變基因型有表皮生長因子受體(EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、C-ros原癌基因1酪氨酸激酶(ROS-1)等，三種基因型的突變、融合可通過激活下游不同信號通路從而調控腫瘤細胞的生長、增殖、分化及轉移等生物學行為〔3,4〕。盡管針對基因突變采用相應的治療可有效提高治療效率，可讓患者生存獲益，但尚缺乏相應的資料表明EGFR、ALK、ROS-1突變與NSCLC預后是否存在相關性〔3,5〕，研究旨在探討EGFR、ALK、ROS-1在肺癌患者組織的表達情況及對預后的評估價值。

1 材料與方法

1.1基本資料 2017年1月至2018年9月收治的80例老年非小細胞肺癌患者，根據1年隨訪預后情況分為死亡組(28例)、存活組(52例)。納入標準〔6〕：①經病理學、影像學檢測確診為肺癌，首診無遠處轉移；②依從研究方案，病例資料完整；排除標準：①存在其他原發性惡性腫瘤或者腫瘤轉移者；②合并心、腎、肝等重要臟器功能障礙，腦血管疾病者。患者及家屬均簽署知情同意書，本研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2臨床資料收集 收集入組患者的臨床資料，包括性別、年齡等一般資料及病理類型、臨床分期等病理資料及隨訪1年患者的生存、死亡情況。

1.3EGFR、ALK、ROS-1基因檢測 采用突變擴增系統(ARMS)檢測EGFR基因，首先收集肺癌組織標本并進行石蠟切片，切片厚度6～8 μm，數量≥10張，然后經二甲苯脫蠟、無水乙醇漂洗、風干，并刮取裝入1.5 ml EP管中，隨后按照DNA提取試劑盒(德國QIAGEN)操作說明提取DNA，純度(A260/A280比值)在1.8～2.2范圍內則表明操作合格。隨后將DNA稀釋至2 ng/μl，于42.3 μl DNA模板中加入2.7 μl Taq酶液，混勻后分裝到含有反應液的8聯管中，5 μl/管，短暫離心后用熒光定量PCR儀(型號ABI7500)進行測定，反應條件如下：先在95℃條件下預變性5 min，接著95℃×25 s、64℃×20 s,72℃×20 s，15個循環，93℃×25 s、60℃×35 s、72℃×20 s，31個循環，60℃收集FAM和VIC信號并進行數據分析即可。

采用熒光原位雜交技術(FISH)檢測ALK、ROS-1基因，具體操作如下：石蠟切片(厚度4 μm)后60℃烤片2 h，隨后二甲苯脫蠟、無水乙醇漂洗、風干，并將切片浸入至93℃的超純水中溫孵30 min，取出切片后用超純水清洗，置入酶消化液中(10～20 min)進行消化處理，取出后超純水浸洗終止消化，風干切片并加入探針，蓋上蓋玻片并外封，接著放入雜交儀中變性80℃×5 min，雜交37℃×16 h。待雜交完成后清洗切片并置入檸檬酸鈉緩沖液(SSC)溶液中3 min，去除蓋玻片，再次于73℃ SSC溶液中溫孵3 min，取出風干加入10 μl 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)，蓋好蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察染色結果。細胞陰性判定：產生1個橙色、綠色融合信號；細胞陽性判定：單獨存在的1個橙色熒光信號，或者1組橙色和綠色熒光信號，其間隔距離超過兩個信號半徑大小,至少計數50個腫瘤細胞中，以15%為臨界值，若超過15%的細胞表現為陽性則判斷為陽性。

1.4統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、Kaplan-Meier 法、Log-rank檢驗。

2 結 果

2.1肺癌組織EGFR、ALK、ROS-1突變與臨床病理特征的關系 ALK陽性患者8例(10.00%)，ROS-1陽性患者2例(2.50%)，EGFR陽性患者35例(43.75%)。肺癌組織EGFR、ALK均與淋巴結轉移、分期、分化程度、預后相關(P<0.05，P<0.01)，見表1。

表1 肺癌組織EGFR、ALK、ROS-1突變與臨床病理特征的關系(n)

2.2肺癌組織EGFR、ALK、ROS-1突變與預后關系 80例老年NSCLC患者，通過Kaplan-Meier 生存分析，整體無進展生存期(PFS)中位時間為7.44個月。通過Log-rank 檢驗，肺癌組織EGFR、ALK、ROS-1呈現陽性時，患者PFS顯著長于陰性(P<0.05)。Log-rank檢驗結果顯示ALK、ROS1及EGFR突變與患者的PFS相關(均P<0.001)，見表2。

表2 肺癌組織EGFR、ALK、ROS-1突變與預后關系

2.3肺癌組織EGFR、ALK、ROS-1突變與NSCLC患者獨立預后危險因素的相關分析 經對患者的癌組織EGFR、ALK、ROS-1突變及腫瘤分化程度、分期、淋巴結轉移進行PFS的Cox回歸多因素分析，結果顯示EGFR、ALK、ROS-1突變及腫瘤分化程度、分期、淋巴結轉移可作為影響NSCLS患者PFS的獨立預后危險因素，見表3。

表3 患者生存影響多因素分析結果

3 討 論

統計數據顯示NSCLC患者5年生存率僅為15%，因此診治過程中尋找可準確評估非小細胞肺癌生物學行為(如突變耐藥性、轉移性等)及準確預測預后的評價指標對于指導醫師針對性的治療方案至關重要，從而提高診治效率，降低死亡風險〔7，8〕。目前評估NSCLC預后的指標眾多，主要分為血清學指標(癌胚抗原、癌抗原125細胞角質素片段抗原、神經元異性烯醇化酶等)〔9〕、組織學指標(EGFR、ALK、ROS-1、VEGF等)〔4〕，其中血清標志物容易受到多種因素的干擾(吸煙、飲食、感染、生理狀態等)，導致出現假陰性或者假陽性，組織病理學檢測是眾多疾病診斷的金標準，可鑒別正常和病理組織的形態結構，組織學診斷價值較高，且EGFR、ALK、ROS-1均可在肺癌組織中高表達，可有效反映患者癌基因突變類型，從而指導靶向治療方案的選擇。

EGFR作為受體酪氨酸激酶家族成員，與NSCLC、卵巢癌、乳腺癌等癌癥的發生、發展密切關聯，EGFR酪氨酸激酶抑制劑(吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼等)已廣泛用于NSCLC的一線、二線靶向治療〔4〕，關于EGFR的表達情況與患者預后相關性尚存爭議，而此次研究發現EGFR表達水平與預后存在相關性，其陽性患者死亡率顯著低于陰性患者，PFS顯著長于陰性患者。同時研究發現陽性患者具有更高的淋巴結轉移風險，分析認為EGFR的過表達可大量激活下游ras/rsf/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)及磷酸肌醇激酶信號通路，從而調控有絲分裂信號，促進細胞的生長、增殖、分化等生物學行為，同時還能促進血管生成，促進腫瘤細胞侵襲、遠處轉移等，故而增加淋巴結轉移風險。盡管EGFR突變與ALK融合基因在NSCLC患者中有很多共同之處，但兩者相互排斥，合并突變發生率極低，使得ALK融合基因陽性可成為NSCLC患者一種獨立亞型〔10〕。NSCLC中ALK基因常與EML4基因融合，從而促進ALK基因持續表達，進而激活下游磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、MAPK信號通路，促進腫瘤的發生〔11〕。本研究發現NSCLC患者ALK突變陽性率與病理特征(淋巴結轉移、分期、分化程度)具有相關性，且陽性患者具有更高死亡率。Zhao等〔12〕通過meta分析發現ALK融合基因在Ⅲ期、Ⅳ期的NSCLC患者中的檢出率明顯高于Ⅰ期、Ⅱ期患者，高瓊瓊等〔3〕報道顯示NSCLC患者ALK融合基因的陽性率可達9.0%，而早期患者陽性率在2.4%～8.6%，與本研究結果一致，即在晚期患者中具有更高的陽性率。ALK陽性患者淋巴結轉移風險明顯高于陰性患者，表明ALK患者具有淋巴結轉移的生物學特點，也進一步說明晚期NSCLC患者陽性率高于陰性率。研究發現ALK陽性患者的總生存期為97.7個月，明顯高于陰性患者(78.9個月)〔13〕，表明陽性患者具有更優的預后效果，與本研究一致，分析認為患者接受了替尼類藥物的靶向治療，可有效阻滯ALK下游信號通路，從而進一步阻滯腫瘤細胞的生長、侵襲，故而提高治療效果。

ROS-1作為胰島素受體家族中的一種酪氨酸激酶，在NSCLC中可與SLC34A、CD74融合，并激活下游PI3K/AKT、Janus激酶/信號轉導與轉導激活子(JAK/STAT)、RAS/MAPK等信號通路，從而調控腫瘤的發生發展。本研究發現ROS-1基因突變與病理類型、臨床分期等有關，與楊三虎等〔14〕報道一致。ALK和ROS-1在激酶結構域在氨基酸序列、三磷酸腺苷結合位點上均具有同源性，分別為49%、77%，因此目前所有ALK抑制劑均可有效控制ROS-1融合患者(艾樂替尼除外)〔2〕。同時文獻報道發現同一患者中ROS-1融合基因突變、EGFR突變共存率極低，各種基因型突變的共存情況下選中何種激酶抑制劑是臨床尚需進一步論證的方向〔15〕。本研究發現EGFR、ALK、ROS-1突變均與患者的預后具有相關性，陽性患者采用標準化療相對文獻報道的靶向療法具有更低得生存率，為靶向療法及個體化治療提供了理論依據。