miRNA-10a及miRNA-27a在老年乳腺癌患者術后復發轉移監測中的價值

鄒敏 孫奕琛 劉文 李利 (江漢大學附屬醫院 普外科，湖北 武漢 43005；腫瘤科)

外科手術是治療乳腺癌的常用手段，通過切除腫瘤組織避免癌細胞擴散，提高腫瘤局部控制率，改善生活質量〔1〕。但仍有部分患者病情惡化出現復發、轉移，導致治療失敗，尤其老年乳腺癌患者一旦出現復發、轉移，生存質量差，5年生存率低，預后差〔2〕；故需重視其預后評估。調查顯示，腫瘤易感性及進展與miRNA密切相關，超過50%的miRNA定位于腫瘤雜合子缺失區、染色體擴增區等，通過多通路調控腫瘤侵襲及轉移〔3〕。miRNA-10a定位于17號染色體短臂HOXB4及HOXB5基因間隙，目前已被證實與胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤發生相關，可通過促進DNA甲基化調控HOXB4、HOXD4基因轉錄，參與造血細胞分化、免疫調節、癌細胞增殖及進展等過程〔4，5〕。miRNA-27a定位于19號染色體短臂，屬多功能miRNA，已發現miRNA-27a參與宮頸癌、肝癌發病過程〔6，7〕，且與骨代謝疾病、肌肉細胞發育等密切相關〔8，9〕。但對miRNA-10a、miRNA-27a與乳腺癌復發轉移的關系尚未見報道。本研究擬對老年乳腺癌術后復發轉移與未復發轉移患者乳腺癌病理組織miRNA-10a、miRNA-27a水平進行檢測，旨在明確兩者與老年乳腺癌術后復發、轉移的關系，以期為老年乳腺癌術后預后評估提供依據。

1 資料和方法

1.1一般資料 收集2016年1月至2017年6月漢江大學附屬醫院收治的98例老年乳腺癌手術患者的臨床資料。按隨診術后2年復發轉移情況分為復發轉移組32例與未復發轉移組66例。

1.2納入及排除標準 納入標準：年齡≥60歲；經手術病理確診為乳腺癌；接受乳腺癌根治術治療；留存病理蠟塊標本；有完整術后2年隨診結果；臨床及病理資料完善。排除標準：嚴重心肝腎肺疾病；其他原發性惡性腫瘤；活動性感染；無法控制糖尿病或高血壓；嚴重腦血管病；術前已接受放化療或其他抗腫瘤治療；血液系統疾病或凝血功能異常；嚴重精神疾病無法配合；臨床或隨訪資料不全。

1.3主要試劑及儀器 miRNA-10a、miRNA-27a引物及內參引物均由上海生工生物技術服務有限工程公司合計及合成，cDNA第1鏈合成試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；Trizol試劑盒(美國Invirotrogen公司)，實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(日本Takara公司)，Taq-Man miRNA Assays(Applied Bidsystems公司)；高速冷凍離心機(美國Beckman coulter公司)，-80℃超低溫冰箱(日本Sanyo公司)，ND-1000型紫外分光廣度計(NanoDrop公司)，7500型RT-PCR System(Applied Bidsystems公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4方法 留存乳腺癌組織解凍，液氮研磨成粉末，加入Trizol試劑盒提取總RNA，紫外分光度儀測定吸光度A值，A260/A280比值>1.8確定標本滿意后用于監測miRNA，1%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性，反轉錄合成cDNA，1 μl cDNA置于反應體系內94℃擴增120 s，膠回收純化DNA片段，RT-PCR法測定miRNA-10a、miRNA-27a表達水平，嚴格參照試劑使用說明操作，miRNA-10a引物序列為上游：5′-TTACACACGCTTACCCTGTAG-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATC-3′；miRNA-27a引物序列為上游：5′-GGCTTAGCTGCTTGTGAGCA-3′，下游：5′-GCGGAACTTAGCCACTGTGA-3′；U6(內參)引物序列為上游：5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；均以U6為內參，反應體系：上下游引物各1 μl+2×SYBR Green Mix 10 μl+cDNA 1 μl+0.1%滅菌蒸餾水補足，總體積20 μl；擴增條件：95℃ 30 s預變性，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環，每樣品均設3個復孔，PCR產物瓊脂糖凝膠電泳分析，樣品熒光信號達RT-PCR儀器最高閾值時擴增循環數為Ct值，-2△△Ct法計算目的基因相對表達量，△△Ct=(Ct目的基因-Ct內參)〔10〕。

1.5隨訪 患者均接受為期2年隨訪調查，采用電話、門診復查等方式，出院6個月內每3個月隨訪1次，6個月以后每半年隨訪1次，隨訪截止至2019年6月，統計乳腺癌術后復發、轉移情況。

1.6統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗、多因素Logistic回歸分析、受試者工作特征(ROC)曲線分析miRNA-10a、miRNA-27a對乳腺癌術后復發轉移的預測價值。

2 結 果

2.1隨訪2年復發、轉移情況 隨訪2年局部復發13例，淋巴結轉移5例，遠處轉移14例，復發轉移共32例(32.65%)，其中術后1年內11例，1～2年21例。

2.2兩組一般資料比較 兩組病理類型差異無統計學意義(P>0.05)，復發轉移組腫瘤直徑>2 cm、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為低分化、合并淋巴結轉移、雌激素受體(ER)/孕激素受體(PR)均陰性率均顯著高于未復發轉移組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較〔n(%)〕

2.3兩組miRNA-10a、miRNA-27a相對表達量比較 復發轉移組癌組織miRNA-10a、miRNA-27a相對表達量均顯著高于未復發轉移組(P<0.05)，見表2、圖1。

表2 兩組miRNA-10a、miRNA-27a相對表達量比較

圖1 兩組乳腺癌組織miRNA-10a、miRNA-27a RT-PCR產物

2.4老年乳腺癌術后復發轉移影響因素分析 以術后復發轉移為因變量，以單因素分析中有統計學意義數據腫瘤直徑(>2 cm)、臨床分期(Ⅲ～Ⅳ期)、低分化、合并淋巴結轉移、ER/PR均陰性率、miRNA-10a、miRNA-27a作為自變量，進行多因素Logistic回歸分析(α入=0.05，α出=0.10)，結果顯示：臨床分期(Ⅲ～Ⅳ期)、低分化、合并淋巴結轉移、ER/PR均陰性率、miRNA-10a、miRNA-27a均為老年乳腺癌術后復發轉移的影響因素(P<0.05)，見表3。

表3 老年乳腺癌術后復發轉移影響因素

2.5miRNA-10a、miRNA-27a對老年乳腺癌術后復發轉移的預測價值 ROC曲線分析見表4、圖2。

表4 miRNA-10a、miRNA-27a對老年乳腺癌術后復發轉移的預測價值

圖2 miRNA-10a、miRNA-27a預測乳腺癌術后復發轉移的ROC曲線

3 討 論

miRNA屬小分子非編碼RNA，有證據顯示，此類RNA在乳腺癌中扮演癌基因及抑癌基因角色，參與腫瘤侵襲、轉移等級聯過程，同時與上皮間質轉化及腫瘤肝細胞生成密切相關〔11，12〕。早期乳腺癌miRNA表達譜中已發現20余種miRNA表達與正常組織存在差別〔13，14〕。最新研究提出，miRNA可作為腫瘤預后評估依據，與腫瘤侵襲、轉移等惡性生物學行為有關〔15〕。miRNA-10家族位于同源異型和基因HOX簇內，參與生長調控過程，目前已發現miRNA-10a在甲狀腺癌組織異常上調，高出癌旁組織10余倍〔16〕。也有數據顯示，胰腺癌細胞系內miRNA-10a呈明顯高表達，干擾miRNA-10a表達可抑制癌細胞侵襲〔17〕。本研究對老年乳腺癌癌組織miRNA-10a表達情況監測發現，其miRNA-10a表達較Lee等〔18〕報道的正常乳腺組織高，且隨訪2年內出現復發、轉移患者癌組織miRNA-10a水平明顯高于未復發轉移組，證實miRNA-10a可能參與乳腺癌侵襲轉移過程，分析機制可能與miRNA-10a存在癌基因作用，可通過調控細胞黏附分子表達，促進癌細胞克隆、增殖，增加其侵襲性，促進其遷移，進而促成乳腺癌復發、轉移有關。

miRNA-27a被認為是典型癌基因miRNA，肝癌中miRNA-27a可通過提高轉錄因子蛋白表達，提高細胞黏附分子表達〔19〕；胰腺癌中miRNA-27a可靶向調控Spry2表達，調節細胞生長、克隆及侵襲〔20〕；子宮內膜癌中抑制miRNA-27a表達可促進癌細胞G1期停滯及凋亡〔21〕。本研究與Li等〔22〕假設觀點一致，推測乳腺癌組織miRNA-27a表達異常上調可能促成癌細胞侵襲、轉移。本研究與早期報道〔23，24〕結論相符，主要與臨床分期靠后、病理分化程度低、ER/PR陰性、伴淋巴結轉移的乳腺癌患者癌細胞侵襲性強、癌細胞新生血管多，腫瘤血供豐富，更易呈現侵襲性生長、擴散轉移等惡性生物學行為，腫瘤細胞易擴散進入血循環，造成復發、轉移〔25，26〕。此外，本研究發現miRNA-10a、miRNA-27a為老年乳腺癌術后復發轉移的獨立危險因素，推測miRNA-10a、miRNA-27a在乳腺癌進展過程中可能發揮原癌基因作用，促成癌細胞侵襲、轉移，造成乳腺癌復發。且兩者對乳腺癌術后復發、轉移有較高的預測價值，因此對miRNA-10a、miRNA-27a水平超過臨界值的乳腺癌患者需強化術后隨訪追蹤，警惕復發、轉移。

綜上，老年乳腺癌術后復發轉移患者癌組織miRNA-10a、miRNA-27a相對表達量較高，兩者對乳腺癌復發、轉移均有較高的預測價值，有望作為老年乳腺癌預后預測的新分子標志物。但本實驗獲取樣本量少，且尚未分析miRNA-10a、miRNA-27a與乳腺癌病理參數的關系，存在一定的局限性，對miRNA-10a、miRNA-27a與乳腺癌術后復發轉移的關系及其具體機制尚待驗證。