白花丹素通過調控miR-218-5p/CNTN1表達對子宮內膜癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響及其機制

李愛玲 李虹 陳莉萍 (華中科技大學附屬武漢市第四醫院，湖北 武漢 430034)

子宮內膜癌屬于女性生殖系統常見惡性腫瘤，子宮內膜上皮內瘤變等多種因素均可導致子宮頸內膜癌發生，由于女性內分泌系統的復雜性導致子宮內膜癌發病機制尚未完全闡明〔1〕。目前臨床常采用手術與激素治療等方法治療子宮內膜癌，由于子宮內膜癌細胞遷移及侵襲能力較強導致患者治療效果差〔2〕。因此探尋子宮內膜癌發生及發展機制，并基于機制研究尋找可有效治療子宮內膜癌的新型藥物對提高治療效果及改善患者預后均有重要意義。研究表明白花丹素可抑制宮頸癌細胞生長并誘導細胞凋亡，并可抑制肝癌細胞的遷移、侵襲〔3，4〕。相關研究發現白花丹素能通過抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡進而抑制膀胱癌發生及發展，同時可明顯抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力〔5〕。 但白花丹素對子宮內膜癌細胞增殖、遷移等惡性生物學行為的影響尚未不清楚。微小RNA(miR)-218-5p在膀胱癌等惡性腫瘤中呈低表達，并可通過調控靶基因表達進而發揮抑癌基因作用〔6〕。通過靶基因網站預測接觸蛋白(CNTN)1可能是miR-218-5p的靶基因，研究表明CNTN1在乳腺癌細胞中表達水平升高并能夠增強乳腺癌細胞的增殖、克隆形成及侵襲能力〔7〕。 但白花丹素及miR-218-5p、CNTN1對子宮內膜癌細胞增殖、遷移侵襲的影響，且白花丹素是否通過調控miR-218-5p/CNTN1表達影響子宮內膜癌細胞的增殖、遷移、侵襲目前還尚未可知。因此，本研究觀察白花丹素對人子宮內膜腺瘤細胞(HEC)-1A細胞增殖、遷移及侵襲的影響，并初步分析其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗細胞與主要試劑 HEC-1A購自上海生命科學院細胞中心。胎牛血清、DMEM培養基、Lipofectamine2000轉染試劑均購自美國Invitrogen公司；噻唑藍(MTT)試劑、熒光素酶檢測試劑均購自美國Promega公司；miR-218-5p mimic、 CNTN1 siRNA、miR-218-5p抑制物(anti-miR-218-5p)及其各自陰性對照序列均購自美國Ambion公司；實時熒光定量-聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒購自美國ABI公司；兔抗人CyclinD1、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、 p21抗體均購自美國Cell Signaling Technolgy公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒均購自美國ThermoFisher公司；Transwell小室與Matrigel基質膠均購自美國BD公司；凝膠試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、電化學發光(ECL)發光試劑盒與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1百花丹素處理、轉染及分組 HEC-1A細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，放入恒溫培養箱培養，培養條件為溫度為37℃、CO2體積分數為5%、相對濕度為95%，收集對數生長期HEC-1A細胞接種于6孔板，采用瞬時轉染技術分別將miR-NC、miR-218-5p mimic、anti-miR-NC、anti-miR-218-5p、si-NC、si-CNTN1轉染入HEC-1A細胞，設置為miR-NC組、miR-218-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-218-5p組、si-NC組、si-CNTN1組，嚴格參照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書進行操作，轉染后6 h更換為新鮮DMEM完全培養基，繼續培養48 h后收集細胞進行后續檢測。白花丹素處理及分組：分別用濃度為1.0、2.5、5.0 μmol/L的白花丹素處理HEC-1A細胞，將HEC-1A細胞分為對照組(不進行任何處理)、白花丹素1.0 μmol/L組、白花丹素2.5 μmol/L組、白花丹素5.0 μmol/L組，同時篩選出白花丹素適宜處理濃度。為明確白花丹素是否通過調控miR-218-5p表達而發揮作用，在轉染anti-miR-218-5p、anti-miR-NC 12 h后使用白花丹素處理24 h，分別設置為白花丹素+anti-miR-218-5p組、白花丹素+anti-miR-NC組，收集HEC-1A細胞進行下一步檢測。

1.2.2細胞增殖實驗 HEC-1A細胞接種于96孔板，密度為8×103個細胞/孔，放入恒溫培養箱繼續培養48 h，每組均設置3個復孔，同時設置陰性對照，分別加入質量濃度為5 g/L的MTT試劑10 μl，繼續培養2h后棄上清液，分別加入100 μl 二甲基亞砜(DMSO)，振蕩溶解30 min，應用酶標儀檢測490 nm波長處各孔吸光度值(OD)，計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/陰性對照OD值)×100%。

1.2.3qRT-PCR檢測miR-218-5p、CNTN1 mRNA表達水平 用Trizol試劑盒提取HEC-1A細胞總RNA，應用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度，取10 ng RNA依據反轉錄試劑盒合成cDNA，miR-218-5p以U6為內參基因，CNTN1以GAPDH為內參基因。qRT-PCR反應體系包括SYBR Green real-time PCR Master Mix(10 μl/孔)、正反向引物各(1 μl/孔)、cDNA(2 μl/孔)，ddH2O補足體系至20 μl。通過95℃預變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，反復循環40次進行PCR擴增反應，每個樣品均設置3個復孔，采用2-ΔΔCt法計算miR-218-5p、CNTN1 mRNA相對表達量。

1.2.4Western印跡檢測CNTN1、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、 p21蛋白表達水平 收集各組對數生長期HEC-1A細胞，加入200 μl蛋白裂解液(RIPA、1%PMSF)，冰上裂解30 min，置于離心機離心15 min，離心機轉速為12 000 r/min，離心后收集上清液，用考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度，取適量蛋白進行10%SDS-PAGE，反應結束后轉移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉2 h，4℃溫度下分別加入適量各蛋白一抗(1∶500)孵育過夜，次日用TBST洗滌3次，15 min/次，室溫下分別加入稀釋比為1∶2 000的二抗，孵育2 h后用TBST洗滌3次，15 min/次，ECL發光液進行顯影反應，曝光后用Scion Image圖像分析系統分析各條帶光密度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶光密度值/GAPDH條帶光密度值。

1.2.5雙熒光素酶報告基因檢測 收集未經轉染的HEC-1A細胞，用胰蛋白酶消化細胞并計數，將細胞以5×104/ml濃度接種于24孔板，待細胞生長匯合率達到60%時進行轉染，參照Lipofectamine2000轉染試劑說明書將HEC-1A細胞分為：miR-218-5p mimic+WT-CNTN1、miR-218-5p mimic+MUT-CNTN1、miR-NC+WT-CNTN1、miR-NC+MUT-CNTN1，每組均設置3個平行反應復孔，轉染后參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組CNTN1相對熒光素酶活性。

1.2.6Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲 細胞遷移實驗：用不含胎牛血清的DMEM培養液加入Transwell小室上室備用，同時選取各組對數生長期HEC-1A細胞，胰蛋白酶消化細胞，用含胎牛血清DMEM培養基重懸細胞(1×105/ml)，取200 μl細胞懸液加入Transwell小室上室，Transwell小室下室加入500 μl含胎牛血清的DMEM培養基，放入恒溫培養箱繼續培養48 h后取出Transwell小室，用PBS洗滌，棉簽擦拭微孔膜內層細胞，酒精固定5 min，結晶紫染色15 min，顯微鏡下隨機選取5～10個視野并計算轉移至微孔膜下層細胞數量。細胞侵襲實驗：配制基質膠與無血清DMEM培養基稀釋比為1∶8的稀釋液，以此稀釋比稀釋Matrigel基質膠，取100 μl稀釋液包被Transwell小室底部的上室面，風干后除去多余液體，并加入不含胎牛血清的DMEM培養液(50 μl/孔)，同時用胰蛋白酶消化各組HEC-1A細胞，棄培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，用含不含胎牛血清的DMEM培養基重懸細胞(1×105/ml)，在Transwell小室上室加入200 μl細胞懸液，在Transwell小室下室加入含胎牛血清的DMEM培養基，放入恒溫培養箱繼續培養48 h，取出Transwell小室，PBS洗滌，棉簽擦拭Transwell小室微孔膜內面細胞，酒精固定5 min，結晶紫染色15 min，顯微鏡下隨機選取5～10個視野觀察并計算移至Transwell小室微孔膜下層細胞。細胞遷移及侵襲實驗均設置3次重復，細胞遷移及侵襲能力均與細胞數呈正比。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結 果

2.1白花丹素對子宮內膜癌HEC-1A細胞增殖、遷移、侵襲的影響(48 h) 與對照組比較，白花丹素不同濃度組HEC-1A細胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)，白花丹素5.0 μmol/L組>白花丹素2.5 μmol/L>白花丹素1.0 μmol/L組(P<0.05);Transwell實驗結果顯示，與對照組比較，白花丹素不同濃度組HEC-1A細胞遷移及侵襲細胞數均明顯減少(P<0.05)，白花丹素1.0 μmol/L組<白花丹素2.5 μmol/L組<白花丹素5.0 μmol/L組(P<0.05);Western印跡實驗結果顯示，與對照組比較，白花丹素不同濃度組HEC-1A細胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達均明顯降低(P<0.05)，且白花丹素1.0 μmol/L組>白花丹素2.5 μmol/L組>白花丹素5.0 μmol/L組,而p21蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，且白花丹素5.0 μmol/L組>白花丹素2.5 μmol/L組>白花丹素1.0 μmol/L組(P<0.05)，見表1、圖1、圖2。

圖1 子宮內膜癌HEC-1A細胞的遷移侵襲(結晶紫染色，×100)

表明白花丹素可通過降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達及提高p21蛋白表達水平進而抑制子宮內膜癌HEC-1A細胞增殖、遷移及侵襲，且呈劑量依賴效應。

2.2白花丹素對子宮內膜癌HEC-1A細胞中miR-218-5p、CNTN1表達的影響 白花丹素干預后子宮內膜癌HEC-1A細胞中miR-218-5p的表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，且白花丹素5.0 μmol/L組>白花丹素2.5 μmol/L組>白花丹素1.0 μmol/L組(P<0.05)。白花丹素干預后子宮內膜癌HEC-1A細胞中CNTN1 mRNA及蛋白表達水平均明顯低于對照組(P<0.05)，白花丹素5.0 μmol/L組<2.5 μmol/L組<白花丹素1.0 μmol/L組，見圖3、表2。結果表明白花丹素可能通過上調miR-218-5p表達并下調CNTN1表達進而參與子宮內膜癌發生及發展過程。由于白花丹素濃度為5.0 μmol/L時對子宮內膜癌HEC-1A細胞的作用效果相對較強，因此后續研究選取白花丹素濃度5.0 μmol/L進行后續實驗研究。

圖2 Western印跡檢測增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

圖3 CNTN1蛋白表達

表2 白花丹素對子宮內膜癌HEC-1A細胞中miR-218a-5p、CNTN1表達的影響

2.3miR-218-5p靶向調控CNTN1的表達 miRNA靶基因預測軟件發現miR-218-5p可作用于CNTN1的3′UTR，見圖4A，通過雙熒光素酶報告基因實驗顯示共轉染重組質粒WT-CNTN1、MUT-CNTN1與miR-218-5p mimic后，與MUT-CNTN1相比，WT-CNTN1與miR-218-5p mimic共轉染后CNTN1的熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，見表3。miR-218-5p組CNTN1蛋白表達水平(0.21±0.03)明顯低于miR-NC組(0.61±0.07，P<0.05);anti-miR-218-5p組CNTN1蛋白表達水平(0.93±0.08)明顯高于anti-miR-NC組(0.62±0.06，P<0.05)，見圖4B。表明miR-218-5p可影響CNTN1活性，CNTN1是miR-218-5p的靶基因，miR-218-5p可負向調節CNTN1表達。

A：CNTN1的3′UTR中含有與miR-218-5p互補的核苷酸序列；B：CNTN1蛋白表達圖4 miR-218-5p靶向調控CNTN1的表達

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.4miR-218-5p過表達對子宮內膜癌HEC-1A細胞增殖、遷移、侵襲的影響 miR-218-5p組HEC-1A細胞miR-218-5p表達水平明顯高于miR-NC組(P<0.05)，表明miR-218-5p mimic能顯著促進HEC-1A細胞miR-218-5p表達。MTT檢測顯示，上調miR-218-5p表達能夠顯著增加細胞增殖抑制率(P<0.05)。Transwell實驗結果顯示miR-218-5p mimic能夠顯著減少HEC-1A細胞遷移及侵襲數(P<0.05)，表現為進入Transwell小室下室的細胞數量明顯減少。Western印跡檢測結果顯示miR-218-5p組HEC-1A細胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達均顯著下調(P<0.05)，而p21蛋白表達顯著上調(P<0.05)，見表4、圖5。表明上調miR-218-5p表達可通過下調CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達及上調p21蛋白表達進而抑制子宮內膜癌HEC-1A細胞增殖、遷移、侵襲。

組別miR-218-5p抑制率(%)遷移細胞數(個)侵襲細胞數(個)CyclinD1蛋白p21蛋白MMP-2蛋白MMP-9蛋白miR-NC組0.99±0.085.17±0.49115.69±10.2392.47±9.230.81±0.080.25±0.030.79±0.070.80±0.08miR-218-5p組3.14±0.2133.27±3.1254.38±6.0246.31±4.250.42±0.040.68±0.060.33±0.040.36±0.04t值23.43521.79412.65211.12710.68115.70113.97612.050P值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000

圖5 Western印跡檢測增殖、遷移、侵襲相關蛋白表達

2.5抑制CNTN1表達對子宮內膜癌HEC-1A細胞增殖、遷移、侵襲的影響 Western印跡顯示si-CNTN1組HEC-1A細胞CNTN1蛋白表達顯著低于si-NC組(P<0.05)，表明CNTN1 siRNA能夠減少HEC-1A細胞中CNTN1表達。與si-NC組比較，MTT實驗結果顯示si-CNTN1組HEC-1A細胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，表明沉默CNTN1表達可抑制HEC-1A細胞增殖能力；Transwell實驗結果顯示si-CNTN1組HEC-1A細胞遷移及侵襲細胞數均明顯減少(P<0.05)，表明沉默CNTN1表達可抑制HEC-1A細胞遷移及侵襲能力；Western印跡顯示si-CNTN1組HEC-1A細胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，而p21蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見圖6、表5。表明沉默CNTN1后可通過上調p21蛋白表達及下調CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達進而減弱子宮內膜癌HEC-1A細胞增殖、遷移、侵襲能力。

圖6 Western印跡檢測CNTN1和增殖、遷移、侵襲相關蛋白表達

組別CNTN1蛋白抑制率(%)遷移細胞數(個)侵襲細胞數(個)CyclinD1蛋白p21蛋白MMP-2蛋白MMP-9蛋白si-NC組0.63±0.066.09±0.61113.47±10.3497.53±9.460.82±0.080.22±0.030.78±0.070.76±0.07si-CNTN1組0.19±0.0329.47±2.6856.83±5.5249.38±4.250.45±0.040.67±0.060.31±0.040.34±0.04t值16.06720.83611.83711.37210.13316.43210.09712.761P值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0010.000

2.6抑制miR-218-5p表達逆轉了白花丹素對HEC-1A細胞增殖、遷移、侵襲的作用 qRT-PCR檢測結果顯示白花丹素預處理后HEC-1A細胞miR-218-5p表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，當轉染入anti-miR-218-5p時HEC-1A細胞miR-218-5p表達水平顯著降低(P<0.05)；Western印跡結果顯示白花丹素預處理后HEC-1A細胞CNTN1蛋白表達顯著降低(P<0.05)，而轉染入anti-miR-218-5p后CNTN1蛋白表達顯著升高(P<0.05)。表明白花丹素可上調miR-218-5p表達進而促使靶基因CNTN1蛋白表達下調。MTT檢測顯示HEC-1A細胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)，Transwell實驗檢測結果顯示遷移與侵襲細胞數均顯著增加(P<0.05)，Western印跡顯示HEC-1A細胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達均顯著上調(P<0.05)，而 p21蛋白表達顯著下調(P<0.05)。表明抑制miR-218-5p表達可逆轉白花丹素對HEC-1A細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。見圖7，表6。

1～4：對照組、白花丹素組、白花丹素+anti-miR-NC、白花丹素+anti-miR-218-5p圖7 CNTN1和增殖、遷移、侵襲相關蛋白表達

3 討 論

子宮內膜癌惡性程度高、遷移及侵襲能力強等特點導致患者死亡率逐年上升，目前臨床采用的治療手段已不能有效延長患者生存時間〔9〕。隨著生物信息學不斷發展，靶向治療成為提高子宮內膜癌患者生存率的重要手段，子宮內膜癌發生及發展過程涉及多種癌基因激活或抑癌基因失活等，因而尋找合適分子靶向治療的靶點及有效治療藥物對殺傷子宮內膜癌細胞及控制疾病進展等均具有研究價值。研究表明miRNA通過調控靶基因表達而抑制上皮-間質轉化功能進而抑制子宮內膜癌細胞遷移及侵襲〔10〕。

白花丹素可通過抑制p38MAPK信號通路及上皮-間質轉化過程進而抑制舌鱗狀細胞癌細胞增殖及遷移能力〔11〕。白花丹素是中藥白花丹根部提取物，可有效抑制非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤細胞遷移及侵襲能力，并可發揮抗腫瘤作用〔12〕。田林強等〔13〕研究表明白花丹素可能通過下調MMP-2/MMMP-9蛋白表達進而抑制骨肉瘤細胞侵襲。Huang等〔14〕研究表明白花丹素可通過誘導ROS引發內質網應激介導的前列腺癌細胞凋亡。以上研究結果說明白花丹素具有顯著抑制BEAS-2B細胞增殖、遷移及侵襲的作用。研究表明通過抑制MMP-2、MMP-9蛋白表達可抑制子宮內膜癌細胞遷移及侵襲，上調p21蛋白表達可抑制CyclinD1蛋白表達進而抑制子宮內膜癌細胞增殖〔15，16〕。結果證實白花丹素可明顯減弱BEAS-2B細胞增殖、遷移及侵襲能力。提示白花丹素可通過上調p21蛋白表達及降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達進而減弱子宮內膜癌細胞增殖、遷移及侵襲能力。然而，關于白花丹素對子宮內膜癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的抑制作用還需進行深入研究。

miR-218-5p在前列腺癌患者血清中呈高表達并可作為評估疾病進展的有效標志物〔17〕。Xu等〔18〕研究表明miR-218-5p可通過調控LYN/NF-κB信號通路勁兒抑制宮頸癌細胞的生長和轉移。Zhu等〔19〕研究表明miR-218-5p可通過抑制EGFR表達進而抑制非小細胞肺癌細胞增殖及遷移。然而，miR-218-5p在子宮內膜癌中的表達變化尚未可知。通過靶基因網站預測到CNTN1可能是miR-218-5p的靶基因，研究表明CNTN1可促進前列腺癌細胞增殖及遷移進而促進癌癥進展過程〔20〕。趙冀等〔21〕研究表明肝細胞癌患者癌組織中CNTN1呈高表達并可能參與肝細胞癌細胞遷移及侵襲過程，同時可作為臨床評估患者預后的重要分子標志物。陳楠等〔22〕研究表明上調CNTN1表達可促進乳腺癌細胞增殖。本研究結果提示miR-218-5p可通過調控靶基因CNTN1表達而抑制子宮內膜癌細胞增殖、遷移及侵襲，其可能作用機制與下調CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達及上調p21蛋白表達有關。

白花丹素對子宮內膜癌細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用是否通過miR-218-5p/CNTN1軸而實現的，本研究結果提示白花丹素可通過上調miR-218-5p表達并下調CNTN1表達進而減弱HEC-1A細胞增殖、遷移、侵襲能力。

綜上，白花丹素可通過上調miR-218-5p表達可通過靶向CNTN1而抑制子宮內膜癌細胞增殖、遷移及侵襲，白花丹素可能作為一種新型藥物治療子宮內膜癌，可為子宮內膜癌抗腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲的臨床治療提供理論支撐。但還需進一步采用體內研究來明確白花丹素的抗腫瘤活性是否與抑癌基因miR-218-5p激活、促癌基因CNTN1失活有關，關于其通過何種信號通路傳遞信號均需深入研究。