子癇前期患者胎盤組織中環狀RNA差異表達的生物信息學分析

佟春曉，陳海英，孫曼妮，孟濤

（中國醫科大學附屬第一醫院產科，沈陽 110001）

子癇前期是以高血壓和尿蛋白作為主要診斷的妊娠疾病，是導致圍產期母胎死亡的主要原因之一，發病率約為3%～5%，可導致嚴重的多系統器官損害，威脅孕產婦生命。目前，該病缺乏真正有效的治療手段，維持母胎穩定直至在適當時機終止妊娠，是目前該病的管理策略。研究［1］表明，子癇前期的發生和發展可能導致孕婦晚年的心血管功能受損，為了保障母胎安全、改善產婦預后，深度探索子癇前期的發病機制，并根據其發病機制尋找真正有效的分子預測和治療手段至關重要。

環狀RNA（circular RNA，circRNA）是反向剪接產生的非編碼RNA，由于具有共價閉合的環結構，保護其免受核酸外切酶介導的降解，具有很高的穩定性。近年來，子癇前期circRNA相關研究集中在胎盤因子的表達變化及circRNA對胎盤滋養細胞功能的影響。考慮單個芯片數據集樣本量較少，可信度不高，本研究對子癇前期患者與正常對照孕婦胎盤組織進行比較，對子癇前期患者胎盤circRNA芯片數據集進行整合和重新分析，得到更有意義的差異表達的circRNA，并預測可能與circRNA相互作用的微RNA（microRNA，miRNA），進行篩選、鑒定和功能預測，以深入探討子癇前期發生和發展中改變的基因表達和生物代謝過程，為子癇前期預測和診治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 circRNA芯片數據采集

基因芯片數據集GSE96984和GSE102897均來源于美國國家生物技術信息中心的高通量基因表達數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）。GSE96984和GSE102897的circRNA芯片均基于GPL22120平臺（Agilent-078298 human ceRNA array V1.0 4X180K）。GSE102897根據其研究方案可知，研究對象為3例重度子癇前期患者和3例正常對照孕婦的胎盤組織。GSE96984根據其研究方案可知，研究對象為3例子癇前期患者和4例正常對照孕婦的胎盤組織。本研究通過生物信息學方法，聯合分析2個數據集的基因芯片數據，芯片數據已通過Quantile算法歸一化處理。

1.2 差異基因的篩選

R語言limma包篩選組間差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）。對樣本質檢表達量的差異倍數（fold change，FC）取對數，用于評價基因的表達水平，若P＜ 0.05且|logFC|＞2，認為有統計學意義。采用Pheatmap軟件包繪制熱圖，提示差異基因在樣本中的表達。

1.3 維恩圖繪制

利用維恩圖在線繪制工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）制作維恩圖，將GSE102897和GSE96984兩個數據集篩選出的差異基因取交集。

1.4 miRNA預測

通過兩者聯合分析共同篩選的基因，按|logFC|值進一步篩選，從大到小排列前10位circRNA的miRNA經過人類癌癥特異circRNA數據庫（cancerspecific circRNA database，CSCD）網站（http：//gb.whu.edu.cn/CSCD/）預測。

2 結果

2.1 子癇前期患者胎盤組織中差異表達的circRNA

通過P＜ 0.05且|logFC|＞2篩選后，按照|logFC|從大到小排列，篩選差異表達的前10個circRNA。與對照組相比，子癇前期患者胎盤組織中GSE96984芯片前10條circRNA均表達上調（表1），GSE102897芯片前10條circRNA均表達下調（表2）。

表1 GSE96984芯片差異表達的前10個circRNATab.1 Top 10 differentially expressed circRNA candidates identified in the GSE96984 circRNA microarray

表2 GSE102897芯片差異表達的前10個circRNATab.2 Top 10 differentially expressed circRNA candidates identified in the GSE102897 circRNA microarray

2.2 火山圖和聚類圖繪制分析差異表達譜

根據芯片篩選出差異表達的circRNA，繪制火山圖和熱圖。紅色和綠色區域代表P＜ 0.05且|logFC|＞2的circRNA，火山圖反映總體基因的表達情況（圖1）。根據circRNA的表達水平，將檢測的circRNA和標本進行聚類分析，紅色代表circRNA表達量相對高，綠色代表circRNA表達量相對低，聚類分析熱圖表明2組樣本中circRNA的表達存在差異（圖2）。

圖1 GSE96984和GSE102897芯片中差異表達circRNA的火山圖Fig.1 Volcano map of differentially expressed circRNAs in the GSE96984 and GSE102897 circRNA microarrays

圖2 GSE96984和GSE102897芯片中差異表達circRNA的熱圖Fig.2 Heat map of differentially expressed circRNAs in the GSE96984 and GSE102897 circRNA microarrays

2.3 維恩圖繪制

GSE102897數據集中通過P＜ 0.05且|logFC|＞2篩選出653個差異表達circRNA，GSE96984數據集中通過P＜ 0.05且|logFC|＞2篩選出997個差異表達circRNA，兩者聯合分析共同篩選出160個基因（圖3）。

圖3 GSE96984與GSE102897數據集差異表達circRNA的維恩圖Fig.3 Venn diagram of the differential circRNA expression between the GSE96984 and GSE102897 datasets

2.4 在子癇前期中具有重要意義的circRNA及其miRNA預測

通過兩者聯合分析共同篩選的基因，按照|logFC|值從大到小排列，進一步篩選得到的前10位circRNA，見表3。前10位circRNA的miRNA經過CSCD網站預測，有4個circRNA定位在人類第7號染色體，預測的miRNA最高頻率出現的為miR-1207-3p。見表4。

表3 GSE96984與GSE102897數據集共同差異表達的前10位circRNATab.3 Top 10 circRNAs differentially expressed in the GSE96984 and GSE102897 datasets

表4 差異表達的circRNA的miRNA預測Tab.4 miRNA prediction of differentially expressed circRNAs

3 討論

近年來，人們逐漸在多個疾病領域中對circRNA展開大量研究。研究［2］表明，circRNA在神經發生過程中表達上調，在癌癥和其他細胞增殖率高的疾病中下調，這可能由于細胞增殖后circRNA的表達水平被稀釋。本研究通過生物信息學分析，找到10個在子癇前期患者胎盤組織中顯著差異表達的circRNA，發現其在疾病組織中均表達下調。滋養細胞侵襲力下降是子癇前期的致病學說之一。在本研究中，與對照組相比，在子癇前期患者胎盤組織中有顯著差異的circRNA，其表達均下調，與細胞增殖、侵襲水平變化的癌癥的整體表達情況不一，可能由于子癇前期的發病多源性。circRNA的表達水平不僅影響滋養細胞的侵襲能力，還可能通過其他機制促進疾病的發生。由于目前關于circRNA表達水平的研究多為確定時間和空間的報告，缺乏實時動態的研究結果，所以目前circRNA芯片呈現出來的結果可能是疾病相關應激變化的結果。篩選出的10個circRNA里，有4個基因位于人類第7號染色體。內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）與子癇前期的關系已有很多研究報道。1997年就有學者提出第7號染色體上編碼eNOS基因的7q36區域是家族妊娠期高血壓的易感基因位點［3］。有研究［4］認為中國人群的eNOS基因多態性可能對子癇前期有保護作用，但也有研究［5］認為eNOS基因本身對子癇前期易感的證據較弱，對子癇前期易感的是7q36區域。內皮細胞型纖溶酶原激活物抑制因子1也位于染色體7q22.1，學者們對日本、意大利、巴西、奧地利等國家女性中其基因多態性與子癇前期的關系展開了大量研究，發現與子癇前期具有相關性［6］。這些研究說明，第7號染色體區域基因與子癇前期的關系值得深入研究，而本研究發現的位于第7號染色體區域的circRNA更值得進一步探索。

circRNA在子癇前期方面的研究內容包括血液標志物的預測作用和胎盤功能機制。子癇前期的機制研究主要集中在circRNA分子作為競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）調控細胞表型。SHEN等［7］發現circTRNC18通過調節miR-762/Grhl2信號通路，從而抑制滋養細胞的遷移和上皮-間質轉化，參與子癇前期的發生、發展。GAI等［8］探討了hsa_circ_0007121在人類子癇前期胎盤組織中表達下調的潛在機制，發現hsa_circ_0007121靶作用于miR-182-5p/PGF軸，影響滋養細胞上皮-間質轉化。高水平的circZDHHC20至少可以通過部分作為海綿體結合miR-144，從而上調GRHL2抑制滋養層細胞的增殖、遷移和侵襲，參與子癇前期發病機制的調控［9］。體內和體外細胞實驗發現，circ_0063517通過ceRNA機制靶作用于miR-31-5p-ETBR軸，調節子癇前期內皮細胞血管生成作用等［10］。

本研究通過生物信息學分析預測circRNA作為ceRNA結合的miRNA，其中miR-1207-3p頻率較高，值得注意。miR-1207-3p在胃癌組織中表達上調［11］，編碼于染色體8q24區域的非編碼PVT1基因座（前列腺癌的易感位點），可抑制前列腺癌細胞增殖、遷移，并誘導細胞凋亡［12］。目前尚無在妊娠相關疾病中miR-1207-3p的研究，而其家族成員miR-1207-5p被認為與孕期低血清鐵水平及低出生體重兒相關［13］。miR-1207-3p與子癇前期的關系還有待進一步研究。

綜上所述，circRNA及其作為ceRNA發揮功能對子癇前期的發生、發展及預測起到關鍵作用。第7號染色體區域相關circRNA與子癇前期密切相關，值得進一步探索。