曲美他嗪對糖尿病大鼠心肌細胞氧化應激和內質網應激水平的影響

楊智勇，姜旭，朱紅

（中國醫科大學附屬盛京醫院心血管內科，沈陽 110004）

糖尿病是一個全球性健康問題，預計到2030年將會有超過5億5千萬人罹患糖尿病，其最主要的一個并發癥是心血管疾病，在糖尿病患者死亡原因中占2/3以上［1-3］。高糖狀態下，心肌細胞病理生理狀態改變導致心肌細胞肥大，心肌纖維化進一步導致心肌細胞凋亡的發生，從而引發心肌功能障礙，若不及時干預，極易進展成糖尿病心肌病，進而引發全心衰竭［2］。心肌細胞在高糖狀態下發生上述變化的發病機制尚未完全闡明，研究［4］顯示，氧化應激反應和內質網應激深度參與其中，糖尿病患者產生的高水平活性氧（reactive oxygen species，ROS）與體內抗氧化防御系統不平衡，過量的ROS攻擊心肌細胞，加速其凋亡的速度。持續高血糖狀態還可觸發內質網應激，激活分子伴侶糖調節蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）參與的未折疊蛋白反應，啟動程序性細胞凋亡［5］。高糖狀態下，心肌細胞內的氧化應激和內質網應激水平增高并互相協同，導致心肌細胞凋亡的發生，更加重了其向糖尿病心肌病的加速進展［6］。

曲美他嗪是哌嗪類衍生物，可通過抑制心肌細胞線粒體脂肪酸的攝取，促進葡萄糖有氧氧化提供能量，增加其抗氧化能力，并保護心肌免受ROS的損害，它對冠狀動脈血流、心肌收縮力、心率并無影響，而是直接改善心肌能量代謝［7］。但曲美他嗪在糖尿病心肌細胞氧化應激和內質網應激中的作用尚不明確。本研究通過高脂飲食聯合小劑量鏈脲佐菌素的方法，建立穩定、可靠、優質的糖尿病大鼠模型，并給予曲美他嗪進行干預，檢測各組大鼠心肌組織中氧化應激和內質網應激關鍵指標，探討曲美他嗪改善糖尿病大鼠心肌細胞氧化應激和內質網應激水平及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 動物建模與分組

雄性SD大鼠30只，體質量200～220 g，購自北京華阜康實驗動物有限公司。所有入選大鼠均飼養于室溫25 ℃的動物房中，采用標準顆粒適應性喂養1周，自由進食水。將大鼠隨機分為對照組（C組）、糖尿病組（DM組）、糖尿病+曲美他嗪治療組（TDM組），每組10只。C組采用標準飼料進行喂養，DM組和TDM組給予高脂飼料（D12451）進行喂養。喂養4周后，DM組和TDM組按照30 mg/kg劑量一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素，C組大鼠一次性腹腔注射同等劑量的檸檬酸鹽緩沖液。經尾靜脈取血，采用氧化還原方法測定血糖，隨機血糖≥16.7 mmol/L并且持續穩定3 d，為糖尿病大鼠模型建立成功。模型建立成功后，TDM組給予曲美他嗪20 mg·kg-1·d-1灌胃，C組和DM組給予等量鹽水灌胃，持續4周。記錄大鼠每周體質量和血糖的變化情況。本研究中動物建模及處理方法經過中國醫科大學附屬盛京醫院倫理委員會批準，均符合動物倫理學標準。

1.2 主要試劑和藥品

鏈脲佐菌素（美國Sigma公司）；高脂飼料（D12451）（京華阜康實驗動物有限公司）；兔抗大鼠超氧化 物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）抗體、小鼠抗大鼠8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG）抗體、兔抗大鼠Bcl-2抗體、山羊抗大鼠GRP78抗體（美國Santa Cruz公司）；HRP標記的通用型IgG 抗體（北京中山金橋生物技術有限公司）；辣根過氧化物酶標記驢抗山羊、山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗（上海碧云天公司）；曲美他嗪（齊魯制藥有限公司）。

1.3 免疫組化檢測心肌組織SOD-1和8-OHdG的表達

采用10%水合氯醛（3 g/kg）腹腔注射麻醉后處死大鼠。取心尖部組織，置于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，脫蠟至水，加馬血清封閉，3%過氧化氫消除外源性過氧化氫酶，用0.01 mol/L PBS漂洗3次后，分別加入以1 ∶200稀釋的兔抗大鼠SOD抗體和小鼠抗大鼠8-OHdG抗體，4 ℃過夜。然后分別用1 ∶100稀釋HRP標記的通用型IgG抗體孵育1 h，DAB顯色。每組隨機選取8個視野，于200倍顯微鏡下觀察、攝像。采用Image-Pro Plus系統對蛋白表達量進行分析。

1.4 Western blotting檢測心肌組織SOD、8-OHdG、Bcl-2、GRP78蛋白的表達

取大鼠心肌組織100 mg，經研磨、裂解、勻漿、離心后，提取蛋白，采用BCA法測定提取蛋白的濃度。隨后根據濃度進行蛋白電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉，洗 膜，加 入SOD（1 ∶1 000）、8-OHdG（1 ∶1 000）、Bcl-2（1 ∶1 000）、GRP78（1 ∶1 000）抗體4 ℃過夜孵育。洗膜后再選擇合適的二抗室溫下孵育，洗膜液洗膜。在避光條件下發光法顯色，應用凝膠電泳圖像分析系統掃描定量，將掃描后得到的蛋白灰度值與相應β-actin灰度值相比，計算出各組蛋白表達的相對百分比，作為蛋白的相對含量。

1.5 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件處理數據，數據以表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，所有數據進行方差齊性檢驗，方差齊時使用Dunnettt檢驗，方差不齊時使用非參數檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糖尿病大鼠模型建模的基本情況

DM組和TDM組大鼠毛發粗糙，而C組大鼠毛發順滑。干預期間，DM組大鼠死亡3只，TDM組大鼠死亡1只，C組大鼠無死亡。

統計建模0周和第1、2、3、4周末大鼠的體質量和血糖。0周時，3組比較，體質量無統計學差異（P＞ 0.05）；與C組比較，DM組和TDM組血糖明顯升高（P＜ 0.05）；且DM組與TDM組比較，血糖無明顯差異（P＞ 0.05）。第1、2、3、4周末，與C組比較，DM組和TDM組大鼠體質量均明顯降低，血糖均明顯升高（均P＜ 0.05）；且DM組與TDM組比較，體質量和血糖均無明顯差異（均P＞ 0.05）。

C組中，大鼠體質量隨時間增加而增長，第1、2、3、4周末體質量均高于0周（均P＜ 0.05），且每周末測得的體質量均高于前一時間點（均P＜ 0.05）；DM組中，大鼠體質量雖然也呈現隨時間增加而增長的趨勢，第1、2、3、4周末體質量均高于0周（均P＜ 0.05），但體質量增長速度較C組下降，僅第2、3、4周末的體質量高于第1周末（均P＜ 0.05），其余各時間點組內比較未見明顯差異（均P＞ 0.05）；TDM組中，大鼠體質量變化不明顯，各時間點組內比較，體質量無統計學差異（均P＞ 0.05）。3組中，各時間點組內比較，血糖無統計學差異（均P＞ 0.05）。上述結果證實，DM組和TDM組糖尿病大鼠模型建模成功。

表1 3組大鼠體質量和血糖的變化情況Tab.1 Changes in body weight and blood glucose level of rats in three groups

2.2 免疫組化檢測曲美他嗪對大鼠心肌組織中SOD表達的影響

與C組相比，DM組大鼠心肌組織中SOD表達明顯下降（P=0.001），而TDM組大鼠心肌組織SOD表達較DM組升高（P=0.012）。說明曲美他嗪可以逆轉糖尿病心肌細胞中SOD下降。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織SOD的表達和比較Fig.1 Detection and comparison of SOD expression in the myocardium of rats in each group using immunohistochemistry

2.3 免疫組化檢測曲美他嗪對大鼠心肌組織中8-OHdG表達的影響

與C組相比，DM組大鼠心肌組織中8-OHdG表達明顯升高（P=0.003），而TDM組大鼠心肌組織中8-OHdG表達較DM組降低（P=0.002）。說明曲美他嗪可以逆轉糖尿病心肌細胞中8-OHdG過度表達。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織8-OHdG表達和比較Fig.2 Detection and comparison of 8-OHdG expression in the myocardium of rats in each group using immunohistochemistry

2.4 Western blotting定量檢測曲美他嗪對大鼠心肌組織中氧化應激關鍵指標的影響

利用Western blotting定量檢測各組大鼠心肌組織中氧化應激關鍵指標SOD、8-OHdG、Bcl-2和GRP78蛋白的表達量。結果顯示，與C組比較，DM組中SOD、Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，8-OHdG、GRP78蛋白表達水平明顯升高，而TDM組SOD、Bcl-2蛋白表達水平明顯高于DM組，8-OHdG、GRP78蛋白表達水平明顯低于DM組，差異均有統計學意義（均P＜ 0.05）。說明曲美他嗪可以逆轉糖尿病時心肌組織中氧化應激水平的升高。見圖3。

圖3 Western blotting檢測各組大鼠心肌組織中氧化應激關鍵指標Fig.3 Detection and comparison of oxidative stress key indicators in the myocardium of rats in each group using Western blotting

3 討論

糖尿病是一種以慢性代謝性紊亂為表現的內分泌系統疾病，因代謝失調和氧化應激可引發一系列并發癥，包括心肌病、視網膜病變、神經病變和腎病。在無高血壓和冠狀動脈疾病的情況下出現的心肌功能障礙被稱為糖尿病心肌病，早期表現為左心室舒張功能損傷，伴有心肌細胞肥大、心肌纖維化和心肌細胞凋亡的發生，進而出現收縮功能障礙。糖尿病心肌病的發病機制極其復雜，目前已知有糖代謝、脂代謝、鈣調節異常、氧化應激、炎癥反應、內質網應激、線粒體自噬等多種因素參與［8-9］，如果不在糖尿病早期心肌細胞病變時及時干預，會造成嚴重不良后果。

氧化應激在糖尿病心肌細胞損傷及糖尿病心肌病的發生、發展中起重要作用，細胞內氧化應激產生的ROS與機體內抗氧化防御系統不平衡，過量的活性氮介導細胞蛋白質及核酸損傷，引發細胞凋亡，從而引起組織器官功能障礙［10］。SOD是抵抗ROS 的第一道防線，可降低細胞內外ROS水平，具有抗氧化作用，能夠有效的抑制氧化應激。ROS介導的DNA損傷在修復過程產生鳥嘌呤修飾產物8-OHdG，鳥嘌呤在DNA堿基中氧化性最強，因此8-OHdG可作為DNA氧化性損傷的標志物。心肌組織中8-OHdG水平，可以反映氧化應激造成心肌損傷的程度［11］。本研究結果顯示，糖尿病大鼠心肌組織SOD蛋白表達下降，8-OHdG表達增多，表明氧化應激途徑可能參與了糖尿病心肌組織損傷的過程。

糖尿病導致的持續高血糖狀態使心肌細胞內未折疊蛋白在內質網腔內聚集，鈣離子穩態和氧化還原狀態失衡等都會引起內質網功能的改變，當超過內質網的處理能力時會觸發內質網應激，啟動程序性細胞調亡，引起炎癥反應。內質網應激的啟動可激活由分子伴侶GRP78參與的未折疊蛋白反應。研究［12］指出，糖尿病大鼠出現心肌舒張功能降低的同時，心肌組織中GRP78升高。本研究結果顯示，糖尿病大鼠心肌組織GRP78蛋白表達增多，表明內質網應激可能參與了糖尿病心肌病心肌組織損傷的過程。

糖尿病心肌組織的高氧化應激和內質網應激水平共同作用，進一步加劇了心肌細胞的凋亡，進展至終末期可導致心肌收縮和舒張功能障礙。研究［13］表明，細胞凋亡Bcl-2家族是參與細胞凋亡的重要調節因子，能夠通過促進和抑制凋亡的基因相互作用調節細胞凋亡過程。Bcl-2存在于線粒體內，通過阻止細胞色素C釋放，抑制細胞凋亡和延長細胞存活時間，發揮抑制心肌組織凋亡的作用。高血糖可引起心肌組織中Bcl-2減少，加速心肌細胞凋亡。本研究結果顯示，糖尿病會引起心肌細胞Bcl-2減少，加劇心肌細胞凋亡。

因此，延緩糖尿病心肌病進展的關鍵之一，是有效抑制糖尿病心肌細胞的氧化應激和內質網應激，從而抑制心肌細胞的凋亡。曲美他嗪是治療心絞痛的臨床常用藥，其在心肌細胞線粒體內通過抑制長鏈3酮酰輔酶A 硫解酶，減少脂肪酸氧化攝取，提高葡萄糖氧化供能，改善心肌能量代謝，發揮抗缺血效應。糖尿病心肌細胞對葡萄糖的利用受損，胰島素信號通路發生改變，導致心肌細胞對葡萄糖的攝取和利用降低，增加了游離脂肪酸含量，促進動脈硬化形成，導致心肌彌漫性損傷［14-15］。曲美他嗪通過維持細胞膜磷脂合成功能、抑制鈣超載、防止線粒體損傷，對糖尿病心肌細胞引起的炎癥反應及氧化應激起到抵抗作用，減少心肌細胞凋亡，在預防和治療糖尿病心肌病中已經取得良好的療效［12］。但曲美他嗪對糖尿病心肌細胞氧化應激和內質網應激的作用及其機制的研究尚待完善。

本研究通過建立糖尿病大鼠模型，給予曲美他嗪干預，檢測各組大鼠心肌組織中氧化應激、內質網應激和細胞凋亡指標。結果證實，曲美他嗪處理組大鼠心肌組織SOD、Bcl-2的表達升高，而8-OHdG、GRP78的表達降低。說明曲美他嗪能夠抑制心肌細胞凋亡，對心肌組織起保護作用，其作用機制可能與抑制糖尿病大鼠心肌細胞氧化應激和內質網應激相關。

綜上所述，曲美他嗪升高糖尿病大鼠心肌組織中SOD、Bcl-2的表達，降低8-OHdG、GRP78的表達，可能通過抑制心肌細胞氧化應激和內質網應激對心肌起保護作用。上述指標的具體作用機制，今后需進一步深入研究。