尿液miRNA 檢測在膀胱癌診斷中的價值

楊碧鋒 袁霞妹 張文寶

(浙江金華廣福腫瘤醫院，浙江 金華 321000)

膀胱癌是泌尿系最常見的腫瘤之一，其死亡率排在泌尿系腫瘤的第二位〔1〕。常用于膀胱腫瘤相關檢查的項目有膀胱鏡檢查、盆腔影像學、血清腫瘤標志物、尿沉渣脫落細胞檢查等，但這些方法存在侵入性、操作難、敏感性和特異性低等缺點〔1〕，因而臨床上需要尋找更有價值的診斷標志物。miRNA是一種非編碼的單鏈RNA，對細胞轉移、凋亡、增殖和遷移等功能有顯著影響，對人類1/3的基因起調控作用〔2〕，其異常表達在許多腫瘤中(包括膀胱癌)已被證實〔3，4〕。本研究基于以往基因芯片數據分析，膀胱癌高通量測序結果及對膀胱癌miRNA的研究，選擇表達差異顯著且穩定性、特異性佳的miRNA，探索其在膀胱癌診斷中的價值。

1 材料和方法

1.1研究對象 選取2016年1月至2018年12月浙江金華廣福腫瘤醫院收治的接受膀胱癌手術的患者30例為病例組，收集患者的臨床資料、術前尿液、術后癌組織和癌旁正常組織病理標本。所有患者經尿道膀胱腫瘤電切術或膀胱全切術，術中和術后病理均明確診斷為膀胱癌。男23例，女7例，平均年齡(55.38±7.29)歲，T1期21例，T2期6例，T3期3例，排除標準：①術前曾接受過化療、放療或免疫治療者；②合并有其他腫瘤患者；③合并有泌尿系其他疾病患者；④合并有其他重要臟器嚴重疾病者；⑤膀胱癌再發者。入選同期30例健康體檢者(對照組)的尿液。對照組男20例，女10例，平均年齡(56.24±7.34)歲。兩組年齡、性別等差異無統計學意義(P>0.05)。本研究獲醫院醫學倫理學會批準，所有研究對象簽署知情同意書并自愿參加。

1.2標本采集 術前膀胱癌患者及健康體檢者均留取清晨尿液樣本15 ml，置于-80℃冰箱中保存待檢，收集尿液之前3 d患者未進行任何侵入性操作(包括膀胱鏡、尿道沖洗等)。術中標本離體后采集新鮮膀胱癌組織標本及相應正常黏膜組織標本，所有新鮮標本立即放入液氮中凍存30 min后轉至-80℃冰箱中保存待檢。

1.3檢測方法 根據既往膀胱癌高通量測序及基因芯片數據分析結果及文獻對于膀胱癌miRNA的研究報道，選擇以下10個miRNA進行研究：miRNA-20a、miRNA-129、miRNA-21、miRNA-133a、miRNA-8085、miRNA-137、miRNA-143、miRNA-96、miRNA-451及miRNA-212。從美國國家生物技術信息中心官方網站上查詢相應miRNA序列，委托北京天根生物有限公司合成所需引物。使用天根miRcute miRNA熒光定量檢測試驗盒(FP401)進行熒光定量PCR，嚴格根據說明書進行操作，以U6作為內參物，每個樣本做3個重復采用2-△ct法檢測基因表達量。

1.4統計學方法 使用SPSS22.0軟件進行t檢驗，繪制受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結 果

2.1癌組織和癌旁組織中各miRNA的表達差異 膀胱癌患者癌組織中的miRNA-20a和miRNA-21相對表達量均顯著高于癌旁正常組織，miRNA-129、miRNA-133a、miRNA8085、miRNA-451及miRNA-143相對表達量均顯著低于癌旁正常組織，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

2.2膀胱癌患者尿液樣本與健康體檢人群尿液標本中各miRNA表達差異比較 膀胱癌患者尿液中miRNA-21的相對表達量顯著高于健康體檢人群，miRNA-129、miRNA-133a及miRNA-143的相對表達量顯著低于癌旁正常組織，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 癌組織與癌旁正常組織及膀胱癌患者與體檢者尿液中各miRNA表達

2.3各尿液miRNA對膀胱癌的診斷價值 尿液miRNA-129、miRNA-21、miRNA-133a及miRNA-143的AUC較大。見表2。

表2 各尿液miRNA對膀胱癌的診斷價值

2.4尿液miRNA兩兩組合對膀胱癌的診斷價值 尿液miRNA-129、miRNA-21、miRNA-133a及miRNA-143等兩兩組合后AUC均>0.9，其中miRNA-133a+miRNA-143組合的AUC達到0.994，敏感性和特異性是0.975、0.925。見表3。

表3 miRNA-129、miRNA-21、miRNA-133a及miRNA-143兩兩組合對膀胱癌的診斷價值

3 討 論

臨床膀胱癌的診斷幾乎全部依賴于侵入性的膀胱鏡檢查和組織病理學。但是，膀胱鏡檢查有創傷性，且費用昂貴，并不適用于大規模人群的篩查。盆腔影像學檢查也不能發現早期的膀胱癌。許多膀胱癌的腫瘤標志物(如：纖維連接蛋白、膀胱腫瘤抗原)敏感性和特異性均差強人意。尿沉渣細胞中的RNA雖然主要來源于腫瘤細胞，但容易受到各種因素的影響〔5〕，因此也不適用于膀胱癌的診斷。尿上清液中的RNA來源于尿液外泌體和循環中的miRNA，因其受到RNA酶的影響小，所以其理化性質穩定、成分穩定〔6，7〕。Yamada等〔8〕研究發現在尿路上皮細胞癌患者尿液中miRNA-96和miRNA-183的表達水平顯著高于健康體檢者，尿路脫落細胞中miRNA-96的表達水平與尿路上皮細胞癌的臨床特性高度相關。Shi等〔7〕研究也有類似發現。因此尿液miRNA可作為膀胱癌診斷的標志物。

本研究研究對象的尿液、膀胱癌組織及癌旁組織中均檢測出上述miRNA，提示尿液中miRNA作為膀胱癌腫瘤標志物進行診斷是可行的。與以往的相關研究報道有一定的相似性〔9，10〕。另外在本研究中還發現膀胱癌患者尿液中miRNA-21的相對表達量高于健康體檢人群，而miRNA-129、miRNA-133a及miRNA-143的相對表達量則低于健康體檢人群(均P<0.05)，這與國內外的某些研究結果相似〔11，12〕。既往研究表明〔13〕，單個miRNA基因檢測對疾病診斷的敏感性較低，而聯合檢測多次miRNA基因可顯著提高檢測的陽性率。

綜上，聯合檢測miRNA-129和miRNA-143的相對表達量對膀胱癌具有較好的診斷價值。