富勒醇對脂肪間充質干細胞生物活性及成骨分化的影響

唐艷婷 張琪

1蘇州高新區人民醫院口腔科 215000；2北京大學國際醫院口腔頜面外科 100850

由于外傷、腫瘤及感染等原因造成的骨組織缺損是口腔頜面外科常見的臨床問題。再生醫學的發展為骨缺損的治療帶來了新的希望。自2001年Zuk等［1］首次通過人抽脂術獲得脂肪組織并從中分離出具有多向分化潛能的人脂肪來源的間充質干細胞以來，脂肪間充質干細胞（ADSCs）成為對再生醫學種子細胞研究的又一熱點。在對ADSCs的研究中，最為肯定的研究成果是其向成骨誘導分化。盡管ADSCs對于增強骨修復的有效性在臨床試驗中還未被研究過，但是已有報道證明了ADSCs在各種動物模型中具有增強骨愈合的作用［2-5］。近年來，隨著對碳納米材料研究的不斷深入，以碳納米管、石墨烯、富勒烯衍生物-富勒醇等為代表的碳納米材料在生物醫學領域展現了廣泛的應用前景，如抗氧化性、腫瘤治療和組織工程等［6］。有研究表明抗氧化劑具有增強間充質干細胞成骨分化的作用，如Liu等［7］研究發現具有強氧化性的富勒醇能夠激活小鼠骨髓間充質細胞系（D1）成骨基因的表達。Yamada等［8］在體內外的實驗研究中均表明了抗氧化的小分子N-乙酰半胱氨酸具有增強大鼠骨髓間充質細胞的成骨和骨再生的作用?；谏鲜鲅芯浚覀儊硖接懜焕沾紝Υ笫驛DSCs生物活性和成骨分化的影響，以期提高大鼠ADSCs成骨分化效率，為口腔頜面創傷中基于再生醫學的組織工程治療骨缺損和修復帶來新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD大鼠［雄性，（80±20）g］，由中國軍事醫學科院實驗動物中心提供。

1.2 材料與試劑 富勒醇、油紅“O”（中國軍事醫學科學院基礎醫學研究所前沿交叉學科實驗室）；α-MEM（美國Gibco公司），胎牛血清（FBS）（美國MD genics公司），0.1%膠原酶Ⅰ（德國Roche Diagnostics公司），0.25%和0.05%胰酶、10 mmol/L的β-磷酸甘油鈉、50μmol/L抗壞血酸磷酸鹽、0.1μmol/L地塞米松、0.5μmol/L的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、200μmol/L的吲哚美辛、10μg/ml的胰島素；抗體：CD29、CD45、CD90（美國Biolegend公司）、CD34（美國Santa公司）、CD31（美國Sigma公司）。Alizarin Red S（美國Sigma公司）；Live/Dead細胞活力試劑盒（美國Life Technologies公司）；引物序列（上海英濰捷基貿易有限公司）；ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix（日 本TOYOBO公 司）、TransStart?Top Green qPCR SuperMix（中國全式金公司）。

1.3 儀器與設備 流式細胞儀（美國BD公司）；FTC-3000P Real-Time Quantitative Thermal Cycler（加拿大FB公司）

1.4 方法

1.4.1 大鼠ADSCs分離、培養及傳代 取SD大鼠斷頸處死，75%乙醇消毒，移至超凈臺。無菌條件下切取雙側腹股溝處的脂肪組織，磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）反復沖洗，充分剪碎，用0.1%膠原酶Ⅰ+0.05%胰酶在37℃攪拌條件下消化40 min；終止消化，篩網過濾；800×g離心8 min，去上清，加入10%FBS+α-MEM制備細胞懸液；以2×105個/cm2接種到大皿中，置37℃、5% CO2的培養箱中培養。48 h后首次換液，以后每3 d換液1次。當細胞生長融合達90%后，胰酶消化收集細胞，以1∶3的比例進行傳代，傳代到P3代進行使用。

1.4.2 大鼠ADSCs的免疫表型特征鑒定 取P3代以后細胞進行流式細胞術檢測：取P3代細胞進行，胰酶消化收集細胞制備成細胞懸液，分裝到2 ml干凈的塑料離心管中，按照CD29、CD45、CD90、CD34、CD31的抗體說明書分別加入抗體，37℃暗處孵育30 min，加入適量的PBS，離心、洗去抗體，加入400μl PBS重懸細胞，混勻后，上流式細胞儀進行檢查，用Cell-Quest軟件進行分析。

1.4.3 大鼠ADSCs成脂、成骨多向誘導分化 將P3代細胞以2×104個/孔的密度接種到24孔板中，貼壁24 h后，分別更換為成脂誘導培養基（0.5μmol/L的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、200μmol/L的吲哚美辛、1μmol/L地塞米松、10μg/ml的胰島素）和成骨誘導培養基（0.1μmol/L地塞米松、50μg/ml維生素C、10 mmol/L的β-甘油磷酸鈉），以正常培養基作為對照組誘導14 d后，進行油紅“O”染色和茜素紅染色來檢測成脂、成骨多向分化潛能，光鏡下隨機取圖。

1.4.4 Live/Dead細胞活力檢測 將P3代細胞以2×104個/孔的密度接種到24孔板中，貼壁24 h，更換為加入含有不同濃度（0μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L、10.0μmol/L、100.0μmol/L）富勒醇的培養基（每個濃度設置3個復孔），培養48 h，按照Live/Dead細胞活力試劑盒的說明書進行大鼠ADSCs活力檢測：去除培養基，PBS沖洗3×，用PBS稀釋的Live/Dead染液進行細胞的孵育（37℃，避光）15 min。孵育結束后，PBS沖洗3×除染液。加200μl PBS/孔，萊卡熒光顯微鏡下從每個濃度的3個復孔中隨機獲取10張細胞存活圖像。通過ImageJ2x軟件進行合圖并統計獲得細胞存活比例圖。

1.4.5 富勒醇誘導大鼠ADSCs的成骨分化 將P3代細胞以2×104個/孔的密度接種到24孔板中，貼壁24 h后，更換為成骨培養基將各孔分為兩組：實驗組（成骨培養基＋富勒醇，1.0μmol/L）和對照組（成骨培養基），各設置3個復孔，在誘導14 d、21 d后進行茜素紅染色檢測富勒醇對大鼠ADSCs成骨分化影響，鏡下隨機取圖。

1.4.6 實時定量PCR（q-PCR）檢測 將P3代細胞以1×105個/孔的密度分別接種到6孔板，貼壁24 h后，更換為成骨誘導培養基，將各孔分為兩組：實驗組（成骨培養基＋富勒醇，1.0μmol/L）和對照組（成骨培養基），各設置3個復孔。兩組分別進行成骨誘導14 d、21 d后除6孔板中的培養基，PBS沖洗1×，每孔中加入1 ml Trizol，按試劑說明提取總RNA，用紫外分光光度儀檢測總RNA在A260和A280的吸光度，進行RNA濃度和純度的測定。采用ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix體 系 合 成cDNA第 一 鏈。采 用TransStart? Top Green qPCR SuperMix試劑盒在Real-Time Quantitative Thermal Cycler儀器中進行q-PCR檢測。反應條件：預變性94℃，2 min；變性94℃，20 s，60℃，10 s，72℃，20 s，40個循環。以GAPDH基因為內參基因，采用FTC-3000P的分析軟件，分析各基因表達的相對定量，獲得各樣本中靶基因mRNA的相對含量。引物序列如表1。

1.5 統計學分析 數據處理采用SPSS 17.0軟件進行分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示。Lived/dead細胞活性統計分析采用one-way ANOVA，實驗組與對照組中成骨分化基因的表達比較采用t檢驗進行。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠ADSCs的細胞形態 倒置顯微鏡下觀察，剛分離獲得的原代大鼠ADSCs呈圓形，大部分漂于培養基中。48 h后細胞貼壁生長，呈短小梭形。細胞換液后，隨著培養時間延長，細胞逐漸伸展為長梭形。以1∶3傳代到P3代大鼠ADSCs細胞呈長梭形，細胞形態均一成漩渦狀排列（圖1）。

圖1 倒置顯微鏡下P3代大鼠ADSCs的細胞圖（標尺＝50μm）

2.2 大鼠ADSCs的免疫表型鑒定P3代細胞經過流式細胞術檢測結果顯示，分離、傳代培養到P3代的細胞表達間充質干細胞標志物CD29、CD90陽性率高；但是不表達造血干細胞表面標志物CD45、CD34等標志（圖2），這說明P3代的大鼠ADSCS具有間充質干細胞的免疫表型特征，且純度高。

圖2 大鼠ADSCs流式細胞檢測

2.3 大鼠ADSCs多向分化能力鑒定 成脂誘導14 d后，大鼠ADSCs胞漿內出現圓形透亮串珠樣的脂滴。通過油紅“O”染色，正常對照呈陰性（圖3A），成脂誘導組脂滴被染成橘紅色（圖3B）。成骨誘導14 d后，細胞增殖變慢，細胞呈短梭形。通過茜素紅染色，成骨誘導組可見紅色的鈣化結節即表現為陽性（圖3C），而正常對照組呈陰性（圖3D）。

2.4 Live/Dead細胞活力檢測Live/Dead實驗檢測顯示，在正常培養的大鼠ADSCs中，幾乎無死亡的細胞（紅色，代表死細胞），大部分細胞保持較好的細胞活性（綠色，代表活細胞）（圖4A）。不同濃度富勒醇處理48 h后結果顯示，當富勒醇濃度達到10.0μmol/L并沒有引起大鼠ADSCs細胞的死亡（圖4B～D），達到100.0μmol/L時可見出現死細胞數量較多且細胞形態變為圓球形狀（圖4E），鏡下可見培養基中漂浮少量死細胞。ImageJ2x軟件統計細胞存活率制作統計圖（圖4F）同樣表明了1.0～10.0μmol/L，細胞間存活率無明顯差異，在100.0μmol/L時細胞活性明顯降低。

2.5 富勒醇對大鼠ADSCs成骨分化的茜素紅染色1.0μmol/L富勒醇作用于成骨誘導的大鼠ADSCs 14 d和21 d后，經過茜素紅染色結果顯示，與成骨培養基對照組相比，成骨培養基＋富勒醇，1.0μmol/L實驗組的大鼠ADSCs形成了更多鈣化的結節，被茜素紅染色呈紅色（圖5）。

2.6 q-PCR檢測1.0μmol/L富勒醇作用于成骨誘導的大鼠ADSCs 14 d和21 d后，與成骨培養基對照組相比，成骨培養基＋富勒醇，1.0μmol/L實驗組中大鼠ADSCs細胞中與成骨相關基因Runx2、骨鈣素（OCN）、Ⅰ型膠原（ColⅠ）的表達均提高（圖6），說明富勒醇對于大鼠ADSCs成骨分化具有促進的作用。

表1 q-PCR引物序列表

圖3 大鼠ADSCs多向誘導分化能力圖。油紅“O” 染色：A為對照組（成骨培養基），B為實驗組（成骨培養基＋富勒醇，1.0μmol/L）（標尺＝100μm）；茜素紅染色：C為對照組，D為實驗組（標尺＝100μm）

圖4 Live/Dead檢測圖。A～E為Live/Dead熒光染色圖（A為0μmol/L富勒醇，B為0.1μmol/L富勒醇，C為1.0μmol/L富勒醇，D為10.0μmol/L富勒醇，E為100.0μmol/L富勒醇），紅色代表死細胞，綠色代表活細胞（標尺＝100μm）；F為Live/Dead細胞存活率統計圖（與富勒醇濃度為0μmol/L的空白對照組相比，僅100.0μmol/L的富勒醇P＝0.001）

3 討 論

種子細胞是組織工程研究的基礎，也是制約其發展的瓶頸，主要的原因是一些細胞的供體來源少，增殖能力有限，因此無法實現通過大量的進行體外擴增細胞來構建大塊組織［9］。而大鼠ADSCs與其他種子細胞相比，具有取材方便、來源充足、創傷小、細胞增殖快、無免疫排斥反應同時不涉及醫學倫理等問題，因此患者易于接受；在特定誘導培養條件下可分化為脂肪細胞、成骨細胞、心肌細胞等，是目前最常用的種子細胞［10-12］。在本實驗中，我們采用胰酶消化法獲得原代大鼠ADSCs，對P3代細胞進行流式細胞術檢測干細胞免疫原性，通過成脂、成骨誘導分化檢測多向分化能力，以驗證分離、傳代培養的細胞為純度高的，具有多向分化潛能的干細胞。

近年隨對碳納米材料研究的不斷深入，各類富勒烯被用于生物醫學應用的研究，他們在納米生物技術和納米生物醫學領域發揮重要的作用［13］。但是富勒烯因其水溶性差，使其生物醫學領域的應用嚴重受限，而作為富勒烯水溶性衍生物的富勒醇由于制備簡單且具有強大的水溶性［14］。因此富勒醇被認為是富勒烯用于生物醫學研究中最佳的候選者［15］。我們目前的實驗數據顯示富勒醇作用于大鼠ADSCs在劑量達到10.0μmol/L仍是沒有細胞毒性的，達到100.0μmol/L對細胞形態及活性會有一定影響，這與目前作用于其他組織和細胞的研究結果基本是一致的［16-18］。而當劑量更高時是否對細胞具有致死性，以及這種致死性是否存在劑量和時間的依賴性還需要進一步的實驗證實。

Runx2是骨細胞特異轉錄因子，可以調控間充質干細胞向成骨細胞分化對骨組織的形成和重建具有重要的作用［19］。而ColⅠ是成骨細胞分泌的基質，是鈣鹽沉著和細胞附著的支架［20］它在增殖期即開始表達，基質合成期達到高峰。OCN是成骨細胞分化成熟的標志，在骨礦化期表現為高度增加，而后開始逐漸降低［21-22］。在本研究中，基于已有的研究報道，結合對大鼠ADSCs進行的細胞生物活性的檢測，我們選擇使用較高濃度的富勒醇（1.0μmol/L）作為實驗組，進行其對大鼠ADSCs成骨分化的影響。通過茜素紅染色定性分析，富勒醇具有促進大鼠ADSCs成骨分化的作用。采用q-PCR技術我們定量分析成骨分化基因Runx2/OCN/ColⅠ在大鼠ADSCs中的表達，結果表明與對照組相比，實驗組中3種基因的表達量均增高，這與茜素紅染色結果相一致。而富勒醇對于促進大鼠ADSCs向成骨分化的作用，是否與劑量相關還須進一步實驗驗證。若將富勒醇作為用于增強骨再生治療的新型藥物的候選者，需要進一步開展富勒醇處理的ADSCs移植到體內的實驗以確認其骨再生的作用效果。

目前已有眾多的研究表明，氧化應激可能是調控成脂和成骨的一個關鍵因子。Dugan等［23］表明水溶性富勒烯衍生物可以在家兔骨性關節炎模型中作為保護劑對抗應激和代謝相關的關節軟骨退變。Barbagallo等［24］研究表明，抗氧化基因血紅素加氧酶-1（HO-1）能夠抑制人骨髓間充質干細胞的成脂作用促進其成骨。Liu等［7］研究表明，富勒醇可通過降低氧化應激的水平來減少骨髓間充質干細胞成脂分化，促進成骨分化。本研究雖然已經證明了富勒醇具有促進大鼠ADSCs成骨分化的作用，但是其中相關的機制需進一步開展實驗進行深入的研究，以為富勒醇作為口腔頜面部骨缺損修復治療中新型藥物提供更加可靠的證據。

圖5 富勒醇處理后大鼠ADSCs茜素紅染色圖（標尺＝100μm）。A為對照組（成骨培養基）14 d，B為實驗組（成骨培養基＋富勒醇，1.0μmol/L）14 d，C為對照組21 d，D為實驗組21 d

圖6 q-PCR測定成骨基因在大鼠ADSCs中的表達。A為實驗組（成骨培養基＋富勒醇，1.0μmol/L）與對照組（成骨培養基）14 d的成骨基因Runx2的表達相比（aP＝0.023，bP＝0.001）；B為實驗組與對照組21 d成骨基因OCN的表達相比（aP＝0.003）；C為實驗組與對照組14 d的成骨基因ColⅠ的表達相比（aP＝0.008，bP＝0.005）

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。