核酸染料在實驗教學(xué)改革中的應(yīng)用與思考

王小燕 林軍

[摘 要] 瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)是基因工程實驗課程教學(xué)中必不可少的一項常規(guī)教學(xué)內(nèi)容。瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)常用的核酸染料EB具有強烈的致突變能力和強致癌性。而核酸染料Genefinder屬于花青類植物染料，毒性很低，使用安全，可有效保護實驗操作者和環(huán)境，且檢測核酸的靈敏度高。論述在基因工程實驗平臺建設(shè)中應(yīng)用無毒的核酸染料Genefinder替代強致癌的EB作為基因工程瓊脂糖凝膠電泳中的核酸染料，闡述核酸染料Genefinder實施于在基因工程本科實驗教學(xué)中的應(yīng)用及成效，并對完善核酸染料Genefinder在基因工程實驗課教學(xué)中的應(yīng)用提出思考。

[關(guān)鍵詞] Genefinder;基因工程;實驗教學(xué);實驗平臺建設(shè);實踐與思考

[基金項目] 2021年度廣西壯族自治區(qū)教育廳，廣西學(xué)位與研究生教育改革課題“研究生核心課程‘系統(tǒng)生物學(xué)與生物信息學(xué)建設(shè)研究與實踐”（JGY2021134）;2019年度桂林醫(yī)學(xué)院校級教學(xué)改革項目“對分課堂在生物信息學(xué)教學(xué)改革中的應(yīng)用探索與研究”

[作者簡介] 王小燕（1983—），女，江西上饒人，碩士，桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院實驗師，主要從事分子生物學(xué)研究;林 軍（1977—），男，廣西桂林人，博士，桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院副教授，主要從事醫(yī)藥生物技術(shù)研究。

[中圖分類號] G642.0 ? [文獻標(biāo)識碼] A ? [文章編號] 1674-9324（2021）30-0128-04 ? [收稿日期] 2021-04-13

一、引言

基因工程（Genetic Engineering）又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)。所謂基因工程是指在分子水平上對基因進行操作的復(fù)雜技術(shù)，是將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細胞內(nèi)，使這個基因能在受體細胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達的操作[1] （P3-6）。理論知識具有抽象、豐富、零碎、更新快等特點，學(xué)生不易理解和掌握[2]。瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)是基因工程相關(guān)實驗課程中必不可少的一項常規(guī)技術(shù)。熒光染料溴化乙啶（Ethidium Bromide，EB）是一種常規(guī)的核酸染料，被廣泛應(yīng)用于觀察、檢測瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺凝膠中的DNA或RNA，具有簡單、快速、靈敏度高的特點[3]。然而EB具有強烈的致突變能力和強致癌性，可插入相鄰堿基平面之間，引起基因突變，對實驗者和周圍環(huán)境都有很大的危害[3-5]。一直以來，桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院的基因工程瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)實驗教學(xué)采用EB染液浸泡的方法染色，由于EB除了劇毒性特點，還具有揮發(fā)性，同時對實驗場地也造成嚴(yán)重污染，需要設(shè)置專門的染色場地，需要對染液、染液杠及相關(guān)用品并做后續(xù)專門處理，這不僅對實驗師生的身體帶來危害，同時也使實驗教學(xué)成本增加，給實驗教學(xué)準(zhǔn)備工作帶來更大的工作量。

核酸染料Genefinder是作為EB的替代品的一種新型染料。與強致癌的EB不同，Genefinder屬于花青類染料，毒性很低，使用安全，可有效保護實驗操作者和環(huán)境。研究表明，GeneFinder與dsDNA結(jié)合熒光信號可增強800～1000倍，檢測核酸的靈敏度是EB染色法的10倍左右，與美國Molecular Probe公司的SYBR Green I染料的靈敏度相當(dāng)[6-8]。鑒于此，該研究在桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院2018級和2019級生物技術(shù)本科基因工程瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)實驗教學(xué)課程中用核酸染料Genefinder替代EB染料，取得良好的效果。

二、核酸染料Genefinder在基因工程實驗教學(xué)平臺建設(shè)中的應(yīng)用

該研究通過比較預(yù)染法（10ul核酸染料Genefinder加入1ml 6×loading buffer混勻，每5ul DNA樣本加入1ul加有染料的6×loading buffer，130V穩(wěn)壓電泳半小時）、染料直接加入凝膠法（10ul核酸染料Genefinder/100ml瓊脂糖凝膠、1ul核酸染料Genefinder/100ml瓊脂糖凝膠、0.5ul核酸染料Genefinder/100ml瓊脂糖凝膠）、后染法 （100ml TBE加入10ul核酸染料Genefinder原液，電泳后直接將膠塊泡30min）三種核酸染料Genefinder使用方法，并對使用濃度和使用條件進行反復(fù)摸索，最終得到在基因工程瓊脂糖凝膠電泳中使用核酸染料Genefinder的最佳實驗條件。該研究使用的核酸樣品為多個公司的DMaker2000。該研究使用的核酸染料Genefinder是上海迪奧生物科技公司產(chǎn)品，它屬于花青素類染料，最大吸收峰是470nm，在可見光范圍。核酸染料Genefinder產(chǎn)品原液為10000×，原液用DMSO溶解。使用的6xloading buffer（上海生工），DNA Maker DL2000（上海生工;愛德森）。該研究實驗結(jié)果顯示，相較于在瓊脂糖凝膠中直接加入EB染料，直接在瓊脂糖凝膠中加入核酸染料Genefinder效果更好，在濃度梯度實驗中，1ul核酸染料Genefinder/100ml瓊脂糖凝膠這個濃度效果最好，每個品牌的Maker2000的每個條帶都很清晰漂亮。而預(yù)染法結(jié)果中所有品牌的Maker2000中的100bp和200bp小片段條帶都看不到，重新用EB進行染色之后可見。采用核酸染料Genefinder后染法結(jié)果顯示條帶不如采用EB后染法清晰。因此，該研究選用直接100ml瓊脂糖凝膠中加入1ul核酸染料Genefinder的方法應(yīng)用于桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院的基因工程本科實驗教學(xué)平臺建設(shè)中，并首先應(yīng)用于2018級和2019級生物技術(shù)本科基因工程瓊脂糖凝膠電泳所有相關(guān)實驗課程教學(xué)中。

三、核酸染料Genefinder在基因工程實驗教學(xué)課程中的應(yīng)用

該研究團隊在桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院2018級和2019級生物技術(shù)本科的基因工程瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)實驗課程中應(yīng)用核酸染料Genefinder（100ml瓊脂糖凝膠中加入1ul核酸染料Genefinder），整個瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)實驗課程在桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室中進行。實驗室內(nèi)配置了多套電泳儀、電泳槽、混勻儀、離心機等基因工程相關(guān)設(shè)備以及DNA提取、RNA提取、質(zhì)粒提取、酶切以及瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)實驗試劑和用品。在上課前的準(zhǔn)備階段，需要根據(jù)上課的班級建好實驗小組，同學(xué)們也先行修習(xí)過相關(guān)的基因工程理論課程，然后教師將設(shè)計好的實驗步驟發(fā)到各個實驗小組的同學(xué)中，同時建議同學(xué)們查找一些相關(guān)的實驗資料。基因工程實驗是理論和實踐結(jié)合緊密的一門課程，學(xué)生在實驗課中動手操作項目較多。在動手操作前對所要操作的內(nèi)容一無所知會影響實驗操作，因此，高水準(zhǔn)的預(yù)習(xí)是實驗成功的第一步。根據(jù)以往學(xué)生反饋，文字版的實驗原理較抽象、不易理解，所以任課教師將實驗原理以小視頻、GIF動圖形式呈現(xiàn)，方便學(xué)生理解。在課堂教學(xué)階段，上課后教師會分析教學(xué)任務(wù)，在實驗過程中以學(xué)生為主體，教師在實驗課上進行指導(dǎo)，配合學(xué)生完成實驗，以便學(xué)生在實驗過程中發(fā)現(xiàn)并解決問題。針對學(xué)生的實驗結(jié)果，任課教師拿出往屆在基因工程瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)實驗教學(xué)課程應(yīng)用EB染料時的實驗結(jié)果，與這次在基因工程瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)實驗課程中應(yīng)用Genefinder染料的實驗結(jié)果做對比分析，然后在不同小組內(nèi)進行討論，最后根據(jù)討論結(jié)果讓不同小組同學(xué)在給定的時間內(nèi)完成本次實驗報告。基因工程實驗結(jié)果最終以實驗報告的形式呈現(xiàn)，實驗報告是對實驗的總結(jié)。學(xué)生在寫實驗報告的過程中對所做的實驗進行回顧，通過精修圖片、查閱文獻，按發(fā)表論文的要求撰寫實驗報告，培養(yǎng)學(xué)生處理實驗數(shù)據(jù)、撰寫高質(zhì)量文章的能力。對不同組遇到的問題，教師需要適度地解釋和引導(dǎo)，而不是完全幫助解決和完成教學(xué)任務(wù)。在整個實驗教學(xué)過程中，要循序漸進，爭取達到最好的教學(xué)效果。在實驗教學(xué)任務(wù)完成后，教師要根據(jù)不同小組的實驗完成情況，給予分析、點評和總結(jié)。上課的同學(xué)都希望自己完成的實驗任務(wù)得到肯定，對于完成實驗教學(xué)任務(wù)較好的同學(xué)要給予表揚，對于完成實驗教學(xué)任務(wù)不太好的同學(xué)也要給予鼓勵和關(guān)注，直到這部分同學(xué)也能獨立、完整地完成全部實驗教學(xué)任務(wù)。