核酸染料在實驗教學改革中的應用與思考

王小燕 林軍

[摘 要] 瓊脂糖凝膠電泳技術是基因工程實驗課程教學中必不可少的一項常規教學內容。瓊脂糖凝膠電泳技術常用的核酸染料EB具有強烈的致突變能力和強致癌性。而核酸染料Genefinder屬于花青類植物染料，毒性很低，使用安全，可有效保護實驗操作者和環境，且檢測核酸的靈敏度高。論述在基因工程實驗平臺建設中應用無毒的核酸染料Genefinder替代強致癌的EB作為基因工程瓊脂糖凝膠電泳中的核酸染料，闡述核酸染料Genefinder實施于在基因工程本科實驗教學中的應用及成效，并對完善核酸染料Genefinder在基因工程實驗課教學中的應用提出思考。

[關鍵詞] Genefinder;基因工程;實驗教學;實驗平臺建設;實踐與思考

[基金項目] 2021年度廣西壯族自治區教育廳，廣西學位與研究生教育改革課題“研究生核心課程‘系統生物學與生物信息學建設研究與實踐”（JGY2021134）;2019年度桂林醫學院校級教學改革項目“對分課堂在生物信息學教學改革中的應用探索與研究”

[作者簡介] 王小燕（1983—），女，江西上饒人，碩士，桂林醫學院生物技術學院實驗師，主要從事分子生物學研究;林 軍（1977—），男，廣西桂林人，博士，桂林醫學院生物技術學院副教授，主要從事醫藥生物技術研究。

[中圖分類號] G642.0 ? [文獻標識碼] A ? [文章編號] 1674-9324（2021）30-0128-04 ? [收稿日期] 2021-04-13

一、引言

基因工程（Genetic Engineering）又稱基因拼接技術和DNA重組技術。所謂基因工程是指在分子水平上對基因進行操作的復雜技術，是將外源基因通過體外重組后導入受體細胞內，使這個基因能在受體細胞內復制、轉錄、翻譯表達的操作[1] （P3-6）。理論知識具有抽象、豐富、零碎、更新快等特點，學生不易理解和掌握[2]。瓊脂糖凝膠電泳技術是基因工程相關實驗課程中必不可少的一項常規技術。熒光染料溴化乙啶（Ethidium Bromide，EB）是一種常規的核酸染料，被廣泛應用于觀察、檢測瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺凝膠中的DNA或RNA，具有簡單、快速、靈敏度高的特點[3]。然而EB具有強烈的致突變能力和強致癌性，可插入相鄰堿基平面之間，引起基因突變，對實驗者和周圍環境都有很大的危害[3-5]。一直以來，桂林醫學院生物技術學院的基因工程瓊脂糖凝膠電泳相關實驗教學采用EB染液浸泡的方法染色，由于EB除了劇毒性特點，還具有揮發性，同時對實驗場地也造成嚴重污染，需要設置專門的染色場地，需要對染液、染液杠及相關用品并做后續專門處理，這不僅對實驗師生的身體帶來危害，同時也使實驗教學成本增加，給實驗教學準備工作帶來更大的工作量。

核酸染料Genefinder是作為EB的替代品的一種新型染料。與強致癌的EB不同，Genefinder屬于花青類染料，毒性很低，使用安全，可有效保護實驗操作者和環境。研究表明，GeneFinder與dsDNA結合熒光信號可增強800～1000倍，檢測核酸的靈敏度是EB染色法的10倍左右，與美國Molecular Probe公司的SYBR Green I染料的靈敏度相當[6-8]。鑒于此，該研究在桂林醫學院生物技術學院2018級和2019級生物技術本科基因工程瓊脂糖凝膠電泳相關實驗教學課程中用核酸染料Genefinder替代EB染料，取得良好的效果。

二、核酸染料Genefinder在基因工程實驗教學平臺建設中的應用

該研究通過比較預染法（10ul核酸染料Genefinder加入1ml 6×loading buffer混勻，每5ul DNA樣本加入1ul加有染料的6×loading buffer，130V穩壓電泳半小時）、染料直接加入凝膠法（10ul核酸染料Genefinder/100ml瓊脂糖凝膠、1ul核酸染料Genefinder/100ml瓊脂糖凝膠、0.5ul核酸染料Genefinder/100ml瓊脂糖凝膠）、后染法 （100ml TBE加入10ul核酸染料Genefinder原液，電泳后直接將膠塊泡30min）三種核酸染料Genefinder使用方法，并對使用濃度和使用條件進行反復摸索，最終得到在基因工程瓊脂糖凝膠電泳中使用核酸染料Genefinder的最佳實驗條件。該研究使用的核酸樣品為多個公司的DMaker2000。該研究使用的核酸染料Genefinder是上海迪奧生物科技公司產品，它屬于花青素類染料，最大吸收峰是470nm，在可見光范圍。核酸染料Genefinder產品原液為10000×，原液用DMSO溶解。使用的6xloading buffer（上海生工），DNA Maker DL2000（上海生工;愛德森）。該研究實驗結果顯示，相較于在瓊脂糖凝膠中直接加入EB染料，直接在瓊脂糖凝膠中加入核酸染料Genefinder效果更好，在濃度梯度實驗中，1ul核酸染料Genefinder/100ml瓊脂糖凝膠這個濃度效果最好，每個品牌的Maker2000的每個條帶都很清晰漂亮。而預染法結果中所有品牌的Maker2000中的100bp和200bp小片段條帶都看不到，重新用EB進行染色之后可見。采用核酸染料Genefinder后染法結果顯示條帶不如采用EB后染法清晰。因此，該研究選用直接100ml瓊脂糖凝膠中加入1ul核酸染料Genefinder的方法應用于桂林醫學院生物技術學院的基因工程本科實驗教學平臺建設中，并首先應用于2018級和2019級生物技術本科基因工程瓊脂糖凝膠電泳所有相關實驗課程教學中。

三、核酸染料Genefinder在基因工程實驗教學課程中的應用

該研究團隊在桂林醫學院生物技術學院2018級和2019級生物技術本科的基因工程瓊脂糖凝膠電泳相關實驗課程中應用核酸染料Genefinder（100ml瓊脂糖凝膠中加入1ul核酸染料Genefinder），整個瓊脂糖凝膠電泳相關實驗課程在桂林醫學院生物技術學院分子生物學實驗室中進行。實驗室內配置了多套電泳儀、電泳槽、混勻儀、離心機等基因工程相關設備以及DNA提取、RNA提取、質粒提取、酶切以及瓊脂糖凝膠電泳相關實驗試劑和用品。在上課前的準備階段，需要根據上課的班級建好實驗小組，同學們也先行修習過相關的基因工程理論課程，然后教師將設計好的實驗步驟發到各個實驗小組的同學中，同時建議同學們查找一些相關的實驗資料。基因工程實驗是理論和實踐結合緊密的一門課程，學生在實驗課中動手操作項目較多。在動手操作前對所要操作的內容一無所知會影響實驗操作，因此，高水準的預習是實驗成功的第一步。根據以往學生反饋，文字版的實驗原理較抽象、不易理解，所以任課教師將實驗原理以小視頻、GIF動圖形式呈現，方便學生理解。在課堂教學階段，上課后教師會分析教學任務，在實驗過程中以學生為主體，教師在實驗課上進行指導，配合學生完成實驗，以便學生在實驗過程中發現并解決問題。針對學生的實驗結果，任課教師拿出往屆在基因工程瓊脂糖凝膠電泳相關實驗教學課程應用EB染料時的實驗結果，與這次在基因工程瓊脂糖凝膠電泳相關實驗課程中應用Genefinder染料的實驗結果做對比分析，然后在不同小組內進行討論，最后根據討論結果讓不同小組同學在給定的時間內完成本次實驗報告。基因工程實驗結果最終以實驗報告的形式呈現，實驗報告是對實驗的總結。學生在寫實驗報告的過程中對所做的實驗進行回顧，通過精修圖片、查閱文獻，按發表論文的要求撰寫實驗報告，培養學生處理實驗數據、撰寫高質量文章的能力。對不同組遇到的問題，教師需要適度地解釋和引導，而不是完全幫助解決和完成教學任務。在整個實驗教學過程中，要循序漸進，爭取達到最好的教學效果。在實驗教學任務完成后，教師要根據不同小組的實驗完成情況，給予分析、點評和總結。上課的同學都希望自己完成的實驗任務得到肯定，對于完成實驗教學任務較好的同學要給予表揚，對于完成實驗教學任務不太好的同學也要給予鼓勵和關注，直到這部分同學也能獨立、完整地完成全部實驗教學任務。