非編碼RNA調控表觀遺傳學概述

張淑萍

（吳江高級中學 江蘇蘇州 215200）

表觀遺傳學（epigenetics）是近年來興起的一門研究生物體或細胞表觀遺傳變異的遺傳學分支學科，它建立在孟德爾經(jīng)典遺傳學的基礎上，主要研究在沒有DNA序列變化的基礎上，基因表達的可遺傳性改變。表觀遺傳現(xiàn)象在生物體的生長、發(fā)育和衰老等生命過程中普遍存在，是非常重要的生命現(xiàn)象。其可以從DNA甲基化、組蛋白的修飾（乙?；?、去乙?；⒘姿峄龋?、染色質重塑、非編碼RNA等多個水平上調控基因表達。

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是一類不編碼蛋白質的RNA，根據(jù)長度可分為長鏈非編碼RNA（lncRNA）和短鏈非編碼RNA（ncRNA），后者包括干擾小 RNA（siRNA）、微 RNA（miRNA）、核內小 RNA（snRNA）、核仁小 RNA（snoRNA）、胞質小 RNA（scRNA）、與Piwi蛋白相互作用的RNA（piRNA）和XistRNA等。其中siRNA、miRNA、lncRNA和piRNA影響基因表達，在基因沉默方面發(fā)揮重要作用進而調控基因表達。

1 siRNA與表觀遺傳學

1.1 siRNA的發(fā)現(xiàn)

1999年Hamilton等人在植物中的后轉錄基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）現(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)了siRNA，并發(fā)表于《科學》。2年后，Elbashir S等人發(fā)現(xiàn)合成的siRNA可誘導哺乳動物體內RNAi作用。

1.2 siRNA的結構

siRNA呈雙鏈結構，其長度通常為21 nt，中間19 nt形成配對雙鏈，兩端為具有磷酸化的5′端和兩個不配對的核苷酸的羥基化3′端，結構圖如圖1所示。

圖1 siRNA的結構示意圖

1.3 siRNA的生物合成

siRNA的生物合成主要包括3個步驟：被Dicer切割形成雙鏈小片段；組裝復合物（RISC）；活化RISC復合物。

1.3.1 Dicer切割

Dicer是一類RNaseⅢ蛋白，當病毒基因、人工轉入基因和轉座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內，會在宿主細胞內轉錄產(chǎn)生于外源基因互補的dsRNA，隨后dsRNA被Dicer酶切割成大小為21～23 nt的雙鏈siRNA。在siRNA二聚體中，與靶mRNA互補、指導其沉默的一條鏈（反義鏈）為“向導”鏈，介導mRNA的降解；另一條鏈（正義鏈）為“旅客”鏈，在siRNA形成有功能的復合體前被降解。

1.3.2 RISC形成

siRNA的裝載需要雙鏈RNA結合蛋白R2D2的幫助，首先R2D2與引導鏈3′端結合，然后與Dicer、siRNA形成RISC裝載復合體。R2D2招募Argonaute蛋白，開始組裝RISC。

1.3.3 RISC活化

Argonaute首先與Dicer發(fā)生相互作用，進行交換后，結合到siRNA雙鏈的一端，再與R2D2交換，將整個雙鏈小RNA都轉載到Argonaute中。之后，Argonaute將乘客鏈降解，形成有活性的RISC。

1.4 siRNA介導的基因沉默機制

siRNA介導的基因沉默機制分為轉錄前水平的基因沉默（TGS）和轉錄后水平的基因沉默（PTGS）兩類，其中PTGS指轉錄后的mRNA的降解進而基因不能表達。

1.4.1 TGS

TGS包括染色體異染色質化和RNA介導的DNA甲基化（RdDM）兩個過程。RITS復合體吸引RDRC復合體（RNA指導的RNA聚合酶復合體，RNA-directed RNA polymerase complex）中的RdRP，RDRC可以擴增雙鏈siRNA。通過與該DNA直接配對或與其轉錄物配對，siRNA將RITS護送到基因組相應位點上。然后，RITS直接募集Clr4，也可以募集組蛋白H3 Lys9甲基轉移酶。甲基化的Lys9募集Swi6，Clr4和Swi6相互作用導致染色體異染色質化。

RdDM現(xiàn)象是Wessenegger在2000年類病毒感染的轉基因植物中發(fā)現(xiàn)的。在植物中接種有復制活性的類病毒后，通過轉基因整合入植物基因組的類病毒cDNA拷貝發(fā)生從頭甲基化，生成的類病毒RNA能夠誘導植物基因組中的同源DNA序列發(fā)生甲基化。此后，在大量非致病性的轉基因植物體系中都發(fā)現(xiàn)了RdDM現(xiàn)象。

1.4.2 PTGS

在核酸酶以及Mg2+的協(xié)助下，siRNA將mRNA切割成長度約為21～23nt的片段，其切割的片段長度由siRNA與mRNA互補配對位置所決定。

1.5 siRNA生物學意義

由于siRNA具有特異性強、安全持久等特點，可以通過制備特定的siRNA導入生物體內有目的地抑制靶基因的表達，如目前發(fā)現(xiàn)其對肺癌和腦膠質瘤等癌細胞均有抑制作用。但是，由于其被發(fā)現(xiàn)運用的時間比較短，尚有許多問題有待解決，如導入率不高、穩(wěn)定性較差等，故還需對其進行更深層次的研究。

2 miRNA與表觀遺傳學

2.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)

1993年，Victor Ambros最早在線蟲的基因中發(fā)現(xiàn)了miRNA lin-4的存在。lin-4是調控線蟲胚胎后期發(fā)育的重要基因，經(jīng)過序列對比后發(fā)現(xiàn)，lin-4轉錄物的小片段和lin-14 mRNA的3′端UTR區(qū)域的重復序列互補配對，可以形成lin-4∶lin-14 RNA-RNA雜交結構，從而實現(xiàn)lin-4對lin-14的轉錄后調控。之后，人們在四膜蟲、植物、動物和人體中均發(fā)現(xiàn)了不同的miRNA。

2.2 miRNA的結構

miRNA是一種長度為18～25 nt類似于siRNA的單鏈非編碼RNA，其5′端有一個磷酸基團，3′端為羥基，不具有開放閱讀框架和蛋白質編碼基團。

2.3 miRNA的生物合成

miRNA通常位于基因間或內含子區(qū)域被轉錄，與許多真核生物基因的轉錄物相似，miRNA是其啟動子與RNA聚合酶Ⅱ結合轉錄而來，其最初轉錄產(chǎn)物為較長的pri-miRNA，中間有一段不完全配對的莖-環(huán)結構。經(jīng)過一次切割為pre-miRNA，再經(jīng)過一次切割產(chǎn)生雙鏈miRNA，雙鏈解鏈形成成熟的單鏈miRNA，經(jīng)過5′端有加帽，3′端有多腺苷酸結構則成為成熟的miRNA。

2.4 miRNA介導的基因沉默機制

miRNA主要通過靶mRNA降解和翻譯抑制2種方式調控基因表達。

2.4.1 靶mRNA降解

在植物體細胞內，miRNA與靶mRNA作用機制與siRNA基本相同，但是miRNA是由Dicer酶加工具有莖環(huán)結構的RNA（正常的細胞產(chǎn)物）雙鏈部分形成的。在動物體細胞內還需要GW182、脫腺苷基因（NOT1/CAF1）、脫帽相關基因（DCP）等對其進行“脫帽脫尾”作用。

2.4.2 翻譯抑制

2002年，Caudy AA在核糖體組分中發(fā)現(xiàn)了miR?NA。2年后，Xuemei Chen在研究擬南芥中發(fā)現(xiàn)，miR?NA-172幾乎可以同來自花器官的同源異性基因APETALA2的mRNA進行完全堿基互補配對，可見它不是通過mRNA的降解途徑，而是阻斷翻譯來沉默目標基因的表達。

2.5 miRNA生物學意義

miRNA具有進化保守性與多樣性，只能在特定的組織和發(fā)育階段表達，可見其在細胞生長和發(fā)育等生理過程中起著重要的調節(jié)作用。miRNA不僅可以調控細胞內基因的表達，而且有不少的證據(jù)表明，在植物和無脊椎動物中，還能作為抗病毒因子抵御病毒mRNA。而在脊椎動物中，miRNA不僅可以抵抗病毒mRNA，而且其本身也是干擾系統(tǒng)的產(chǎn)物。miRNA作為新發(fā)現(xiàn)的小分子調節(jié)物質，只有少數(shù)的miRNA的功能已經(jīng)明確，大部分miRNA的功能還有待深入研究。

3 lncRNA與表觀遺傳學

3.1 lncRNA的發(fā)現(xiàn)

2002年，Okazaki等對小鼠cDNA文庫大規(guī)模測序過程中發(fā)現(xiàn)了長鏈非編碼RNA（lncRNA）。

3.2 lncRNA的結構

lncRNA是一類長度大于200 nt的非編碼RNA轉錄物。根據(jù)染色體上基因組位點或相關的DNA鏈特征，lncRNA可分為正義lncRNA（基因位點通過共享相同的啟動子和某個蛋白編碼基因有重疊）、反義ln?cRNA（基因位點以反向的方式插入在某個一直的蛋白編碼基因中）、基因內lncRNA（基因位于某個蛋白編碼基因的內含子內）、基因間lncRNA（編碼lncRNA的基因位點位于兩個蛋白編碼的基因中）、增強子ln?cRNA（編碼lncRNA的基因位點位于某一蛋白編碼基因的增強子區(qū)域）和環(huán)狀lncRNA（通過共價鍵形成閉合的環(huán)lncRNA，其一般來自可變剪切的編碼蛋白基因，其形成機制有多種方式），如圖2所示。

圖2 lncRNA的類型

3.3 lncRNA的生物合成

lncRNA的來源不同，主要有以下5種：①蛋白編碼基因的結構中段形成一段lncRNA；②染色體重排，即兩個未轉錄的基因與另一個獨立的基因串聯(lián)，產(chǎn)生含多個外顯子的lncRNA；③非編碼基因在復制過程中的反移位產(chǎn)生lncRNA；④局部的復制子串聯(lián)產(chǎn)生lncRNA；⑤基因中插入一個轉座成分而產(chǎn)生有功能的非編碼RNA。

3.4 lncRNA介導的基因沉默機制

研究顯示多種來源的lncRNA在基因表達的調控方面具有相似的作用。近年來研究表明，lncRNA主要通過3個方面控制基因表達進而發(fā)揮表觀遺傳學作用：①基因組印跡：通過生物化學途徑，在一個基因或基因組簇上標記其親本來源信息的遺傳學過程，如在小鼠胎盤中，lncRNA Kcnqlot1和Air能聚集在所沉默的等位基因的啟動子染色質區(qū)域，并以等位基因特異性介導對組蛋白修飾的抑制。②劑量補償效應：以性染色體上的版型連鎖基因在兩種性別里，以相對等同的劑量進行有效表達的遺傳學機制，如在哺乳動物中，表現(xiàn)為雌性個體細胞同型配子XX中，其中一條X染色體隨機失活，在其上面的等位基因完全沉默，不轉錄也不表達任何蛋白產(chǎn)物。③染色質修飾：ln?cRNA招募染色質重構復合體到特定位點進而介導相關基因的表達沉默，如HOXC基因簇轉錄的lncRNA HOTAIR，會募集染色質修飾復合體PRC2，并將其定位到HOXD基因簇位點，改變該區(qū)域染色質修飾狀態(tài)，進而抑制HOXD基因表達。

3.5 lncRNA生物學意義

lncRNA在表觀遺傳調控中起著關鍵作用，具有協(xié)調DNA甲基化、染色質結構重塑和組蛋白化學修飾等作用。lncRNA的作用機制還有許多模糊的地方，但研究發(fā)現(xiàn)有些lncRNA在腫瘤中非常敏感，這為治療癌癥提供了新思路。

4 piRNA與表觀遺傳學

4.1 piRNA的發(fā)現(xiàn)

2006年7月，Girard等人在Nature和Science等雜志幾乎同時報道了哺乳動物睪丸組織中特表達的內源性一類非編碼小RNA，由于其能與Argonaute家族的Piwi亞家族蛋白質結合形成復合體（piRC），故命名為Piwi-interacting RNA，簡稱piRNA。2006年，Lau等人從大鼠睪丸中將此復合體純化出來，發(fā)現(xiàn)piRNA與生殖細胞發(fā)育密切相關。目前piRNA在小鼠和人體中均有發(fā)現(xiàn)。

4.2 piRNA的結構

piRNA是一類長度為26～31 nt的單鏈小RNA，與miRNA一樣，成熟的piRNA分子3′末端具有2′-O-甲基化修飾特征，5′末端第一個核苷酸有尿嘧啶偏向性。不同生物在染色體上分布不同，在小鼠中主要分布在X染色體上，在人體中主要在常染色體上，在果蠅中非常普遍。該甲基化修飾反應是由Huaenhancer（Hen1）催化的，當piRNA完成與Ago3蛋白結合后，便發(fā)生了甲基化修飾。有2′-O-甲基化修飾的結果可以維持piRNA的穩(wěn)定性，避免被RNA小解酶消化和降解。

4.3 piRNA的生物合成

piRNA起源于長單鏈RNA前體，與siRNA和miR?NA不同，其產(chǎn)生與Dicer無關，是通過某種核酸內切酶剪切長單鏈RNA前體（pre-piRNA）的3′末端而形成的。之后，通過與Piwi、AUB和Ago3結合的互補性機制進行循環(huán)擴增，即所謂的“兵乓模型”。

4.4 piRNA介導的基因沉默機制

Piwi-piRNA復合體通過兩種方式抑制基因表達：一種是通過調控形成異染色質和介導DNA甲基化修飾等方式，從而調控轉錄水平基因的表達；另一種是依賴有活性的催化酶沉默轉座子mRNA，進而進行轉錄后控制抑制基因表達。

4.5 piRNA生物學意義

piRNA作為表觀遺傳調控因子，對生殖干細胞發(fā)揮正常的功能起著重要的作用。piRNA的發(fā)現(xiàn)豐富了非編碼小分子RNA的研究內容，但是對piRNA的研究還有許多未知領域。到目前為止，關于piRNA的研究在生殖系統(tǒng)、腫瘤治療、精子發(fā)生和心臟方面已經(jīng)取得了階段性的成果，在醫(yī)學上具有非常廣闊的應用前景。

近幾年表觀遺傳學作為一個新的前沿學科，在個體遺傳和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，而非編碼RNA對基因表達的調節(jié)機制還未完全清晰，也成為生命科學中的一個研究熱點，需要人們進一步探索。