高中生物“基因工程”教學中幾個常見問題的探討

錢雪梅

（南京外國語學校 江蘇南京 210008）

現代社會中，生物學科學發展迅猛，基因工程技術也是日新月異。基于基因工程這部分內容在高中教材中的呈現、高考要求，下面對幾個高頻出現的問題做了整理和簡要闡述。

（1）自然界中的農桿菌侵染植物細胞時，只將其內部Ti質粒中的一段T-DNA侵入并整合到植物細胞中的染色體上，其自身并不侵入植物細胞中，有什么意義？

農桿菌侵染的主要是雙子葉植物和裸子植物，當植物體細胞受損傷時，損傷的部位分泌出酚類物質，如乙酰丁香酮、羥基乙酰丁香酮等物質。這些酚類物質可誘導農桿菌中的Ti質粒中的Vir基因的表達，且表達的一部分產物參與將Ti質粒上T-DNA片段的一條鏈切下，另一部分產物即與該單鏈T-DNA形成復合物，保證復合物的穩定性，同時促進其侵入植物細胞并整合到受體細胞染色體的DNA上。當其T-DNA成功插入植物細胞的染色體組后，其在植物細胞中表達并產生大量的生長素、細胞分裂素及冠癭堿等物質。激素類物質可促進受傷部位的細胞大量增殖形成冠癭瘤，冠癭堿從瘤細胞中分泌出去作為農桿菌的碳源和氮源，同時冠癭堿有利于農桿菌吸附于植物細胞壁上，更有利于其得到更多的有機物，從而更好地進行繁殖。

（2）構建基因表達載體時，在目的基因前后加裝的啟動子和終止子是如何選擇的?

啟動子和終止子是基因表達時RNA聚合酶的識別位點。在體外構建基因表達載體時，啟動子和終止子通常是已經安裝在載體上，只需將目的基因的片段插入到載體中特定的啟動子和終止子之間即可。啟動子和終止子的選擇直接影響目的基因在受體細胞中的表達效率。科研人員通常是根據目的基因受體細胞類型，如特定類型的細胞或特定發育階段的細胞來確定。例如，CMV啟動子是啟動真核基因表達的強有力啟動子，被廣泛應用于構建真核表達載體；而構建原核表達載體常用的是T7啟動子；若僅讓目的基因在神經元中表達，則可選用神經元特異性啟動子（NSE、SYN等）。除此之外，還可選擇受體細胞中特定時空表達的基因啟動子和終止子裝入表達質粒中，從而實現目的基因的時空特異性表達。例如，將人的胰島素基因先導入牛的受精卵中，欲讓其在乳腺細胞中表達，則通常選擇牛的乳腺蛋白基因的啟動子和終止子裝載到表達質粒中。

（3）通過反轉錄法合成目的基因需用逆轉錄酶，還需要DNA聚合酶嗎？

獲取目的基因的方法有多種。方法之一是以目的基因的mRNA為模板通過反轉錄法合成目的基因，此過程中用到的酶是逆轉錄酶，不需要DNA聚合酶參與。大多數反轉錄酶都具有多種酶活性，功能強大。主要包括以下幾種活性：①DNA聚合酶活性：以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程；②RNase H活性：反轉錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，由RNase H從RNA 5′端水解RNA鏈，此過程也由逆轉錄酶完成；③DNA指導的DNA聚合酶活性：以反轉錄合成的DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成互補的DNA鏈，從而可得到一條雙鏈DNA分子，此過程也由逆轉錄酶完成。除此之外，有些逆轉錄酶還有DNA內切酶活性，這可能與病毒基因能整合到宿主細胞染色體DNA中有關。逆轉錄酶的發現對于基因工程技術起了很大的推動作用，它已成為一種重要的工具酶在基因工程的具體操作得到廣泛應用。

（4）如何在人工合成的目的基因中加入限制性核酸內切酶的酶切位點？

通過反轉錄法獲取的目的基因不含有限制酶識別的序列，那如何將目的基因順利地裝載到載體上去的呢？通常是在對目的基因進行PCR擴增時，在設計的目的基因引物的兩端分別加裝兩種限制酶的識別序列，限制酶識別的序列加在引物的5′端。將這兩種引物加入擴增體系中，通過PCR技術擴增得到的目的基因的兩端即含有兩種限制酶的酶切序列，將來用特定的兩種酶識別切割后，在目的基因的兩端即有特定的黏性末端，構建基因表達載體時即可與載體形成正向連接的有效表達載體。

例如，用PCR技術將DNA分子中的A1片段進行擴增，設計了引物Ⅰ、Ⅱ，其連接部位如圖1所示，X為某限制酶識別序列。擴增后得到的絕大部分DNA片段是圖2所示的類型片段。

圖1 引物Ⅰ、Ⅱ與DNA的連接示意圖

圖2 擴增后的大部分DNA片段示意圖

利用PCR技術對DNA分子中的A1片段擴增時，當引物與母鏈通過堿基互補配對結合后，子鏈延伸總是從5′端到3′端。通過兩輪復制后即可得到圖2的片段，經過若干輪的復制后得到的DNA片段大多是此類。若在PCR擴增時，在引物I的5′加裝另一種酶切序列，則該片段的兩端即有兩種限制酶切序列，加裝有兩種限制酶切序列的目的基因在構建基因表達時將被有效利用。

（5）科研工作者在構建基因表達載體時為何常用雙酶切法處理目的基因和載體？

在構建基因表達載體時常用到酶切和酶連的方法，酶切方法包括單酶切和雙酶切。若用同一種限制酶對目的基因和載體進行單酶切，得到的目的基因和載體兩端酶切末端相同，將會出現目的基因和載體的首尾相連即自身環化現象；目的基因與質粒的正向與反向連接等現象。自身環化后的DNA片段的出現將大大降低重組質粒的形成，而且重組質粒中反向連接的機率有50%，目的基因正向連接的表達載體能正常表達產生預期效果，若反向連接目的基因表達時RNA聚合酶進行轉錄時正好是將基因的模板鏈的互補鏈為模板轉錄出mRNA，將不可能翻譯出正常的蛋白質。為了提升目的基因和載體的正向連接的成功率，基因工程的具體操作中常用雙酶切法來構建基因表達載體。雙酶切即采用兩種不同的限制酶（非同尾酶、同功酶）同時對目的基因和載體進行切割，這樣有效防止被切割后的目的基因和載體的自身環化現象，目的基因和載體正確連接形成表達載體的比例大大提高。雙酶切法已被廣泛應用于基因表達載體的構建過程中。

（6）基因工程中為何在同一載體上設計裝載兩個標記基因？

運載體上的標記基因是為了鑒定和篩選導入目的基因的重組細胞。這里以目的基因插入到pBR322的BamH I位點中為例來加以說明：圖3是pBR322質粒結構示意圖，在pBR322質粒含有兩個抗生素抗性基因（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環素抗性基因）；還有單一的BamH I的識別位點。

圖3 pBR322質粒結構示意圖

在將此質粒載體用BamH I酶切后，與用BamH I酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的連接產物直接轉化大腸桿菌。結果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有含有環狀目的基因、含有普通質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌3種。

那么，如何從以上多種混合的大腸桿菌中篩選得到所需的含有目的基因的受體細胞呢？此時，通常是利用兩種抗生素的抗性基因的特點進行篩選。首先將轉化的大腸桿菌涂布在一個含有氨芐青霉素的培養基上，只有導入普通質粒或重組質粒的大腸桿菌能在培養基上生長，而沒有被轉化的大腸桿菌和只被環形目的基因轉化的大腸桿菌會全部死亡。又由于BamH I位點位于四環素的抗性基因中，插入目的基因后就會破壞四環素的抗性基因，四環素的抗性會消失，所以成功導入重組質粒的大腸桿菌將不抗四環素。接著，把生長在含有氨芐青霉素的培養基上的大腸桿菌通過影印法移到含有四環素的培養基上進行克隆化培養，若在含有四環素的培養基上仍能正常的大腸桿菌則導入的是普通質粒的細菌，而不能生長的則應是導入了重組質粒的大腸桿菌，這些才是成功導入了目的基因的大腸桿菌。據此可以將兩個培養皿進行對照，再從第一培養皿中挑選出相應的大腸桿菌進行培養，得到所需的受體細胞。其實導入重組質粒的大腸桿菌中也有一半是無效的，因為目的基因的兩端黏性末端是相同的，然后再利用稀釋涂布培養大腸桿菌，根據培養結果進行判斷。

（7）標記基因和報告基因之間有什么區別與聯系？

標記基因（marker gene）是一種已知功能或已知序列的基因，其編碼產物能夠使轉化的細胞、組織具有對抗生素等的抗性，或者使轉化細胞、組織具有代謝的優越性。常用的標記基因是一些抗生素抗性基因，如在培養基中加入抗生素等選擇試劑的條件下，非轉化的細胞死亡或生長受到抑制，而轉化的細胞能夠繼續存活，從而將轉化的細胞、組織從大量的細胞或組織中篩選出來。標記基因通常用來檢驗轉化成功與否。

報告基因（reporter gene）是一種編碼產物容易被檢測與鑒定的基因，已被克隆且全序列已測定，在受體細胞中不存在、也無相似內源性表達產物。通常要把它的編碼序列和基因表達調節序列相融合形成嵌合基因，或者與目的基因連接成融合基因，在調控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產物來標定目的基因的表達調控，篩選得到轉化體。因此，報告基因不僅也能作為標記基因，還能用于研究基因的表達調控，檢測啟動子的活性，發現新的啟動子，觀察報告基因和目的基因的融合蛋白在細胞內的位置等。在植物基因工程研究領域廣泛應用，如熒光素酶基因（luc），不但無放射性，半衰期短，而且檢測方法靈敏及簡單。將報告基因（熒光酶素基因）與目的基因連接成融合基因，然后構建表達載體，融合基因表達的蛋白質能保留兩種蛋白質各自的功能。

（8）在基因工程中，如何將逆轉錄病毒作為載體來構建基因表達載體的？

基因工程中常用動植物病毒及λ噬菌體的衍生物作為載體來構建基因表達載體，原因是它們有雙鏈DNA分子，可以與目的基因進行連接。而目前基因工程中常以逆轉錄病毒作為載體，其優點是逆轉錄病毒作為載體時可以將外源基因插入到受體細胞染色體，使外源基因隨染色體DNA的復制而復制，并進行表達。

研究發現逆轉錄病毒基因組（RNA）的核心部分包括三個基因：gag基因（編碼病毒的核心蛋白）、pol基因（編碼逆轉錄酶）、env基因（編碼病毒的表面糖蛋白）。而位于這些基因兩端的有LTR序列（含有啟動子、調節基因等），控制著逆轉錄基因組核心基因的表達及轉移。

圖4是構建逆轉錄病毒載體及用于培育轉基因小鼠的流程圖。首先通過逆轉錄法將病毒的RNA進行逆轉形成雙鏈DNA，將其中的gag、pol、env等3個核心基因對應的部分全部切下，并用目的基因替換到相應的部位。然后，將通過以上操作得到的2個DNA分子分別構建基因表達載體并注入到同一個特殊的動物細胞中，2個DNA片段都能在特殊細胞中表達。3個核心基因表達出病毒的外殼蛋白；含有目的基因的DNA片段能轉錄出含有LTR和目的基因的mRNA的RNA片段，在特殊細胞中逆轉錄病毒的外殼即可包裝該RNA片段，形成新型的逆轉錄病毒即為構建的逆轉病毒表達載體，從而成為一種含有目的基因的具有感染力的逆轉錄病毒顆粒。

圖4 構建逆轉錄病毒載體及用于培育轉基因小鼠的流

這種逆轉錄病毒載體作為一種表達載體，在侵染了動物細胞后可以通過反轉錄法形成雙鏈DNA并整合到動物細胞的染色體上，從而可以通過細胞分裂傳給下一代的子細胞，并永久性地表達目的蛋白。