急性髓系白血病中DLX4基因異構體的差異性表達及其臨床相關性分析

冷加燕，張婷娟，林 江，谷 雨，于 迪，馬吉春，錢 軍，周靜東

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一種高度異質性血液系統惡性克隆性疾病，也是較為常見的成人白血病類型[1]。AML發病涉及細胞遺傳學與分子生物學的巨大異質性導致患者預后差異較大[2]。根據中國成人AML治療指南，依據初診時不同染色體及基因突變可將AML患者分為預后良好、中等、不良組[3]。此外，表觀遺傳學涉及的基因表達異常在AML中亦扮演重要角色，并且與患者預后密切相關[4]。許多研究揭示AML中BAALC、MN1、ERG等基因過表達與患者預后不良相關[5]。尋找更多影響AML預后的分子標志，對AML預后精準評估并指導患者個體化及精準治療具有重要臨床意義。

DLX4基因位于17q21.33，是一種轉錄因子，在調控人體組織器官、造血系統形成中起重要作用[6-7]。DLX4基因目前公認有2個異構體，其中轉錄本較長的稱為BP1(NM_138281)，轉錄本較短的稱為DLX7(NM_001934)。已有文獻[8]報道異構體BP1在實體腫瘤呈過表達，并且與患者預后不良相關。異構體DLX7在AML中表達尚未見相關報道。本實驗應用RT-qPCR法檢測AML患者中DLX4異構體的表達及甲基化情況，分析其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2005年10月～2017年12月江蘇大學附屬人民醫院血液科診治的153例AML患者，其中男性90例，女性63例，年齡18～93歲(中位56歲)。另收集37例骨髓捐獻者，其中男性21例，女性16例，年齡32～65歲(中位50歲)。所有AML患者診斷分型按WHO(2016)標準[9]。治療方案參考文獻報道[10]。此外，白血病細胞株K562、SHI-1、U937、THP-1、NB4、HL60、HEL及MV4-11為蘇州大學附屬第一醫院血液科陳蘇寧教授饋贈。SHI-1細胞株培養在10%含鐵胎牛血清的IMDM培養基中，其余細胞株培養在10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中。細胞培養生長壞境均為37 ℃ 5%CO2培養箱。本實驗通過江蘇大學附屬人民醫院倫理委員會批準，同時獲患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1骨髓單個核細胞分離、RNA提取和DNA提取 收取對照組及所有患者骨髓10 mL，使用人淋巴細胞分離液(索萊寶公司，中國)分離出骨髓單個核細胞BMMNCs。應用TRIzol法提取總RNA，提取方法參考Trizol試劑盒說明書。同時通過Puregene Blood Core Kit B(Qiagen公司，德國)提取DNA，方法亦參考試劑盒說明書。

1.2.2逆轉錄及RT-qPCR檢測DLX4的表達 取總RNA 400 ng，采用PrimeScript RT試劑盒(Takara公司，日本)進行逆轉錄。反應條件：37 ℃ 20 min，85 ℃ 5 s。合成的cDNA保存于-20 ℃備用。異構體BP1引物序列：上游5′-TACCCGCTTGGCTTGTCC-3′，下游5′-AACGCTGGTTTAGGTGCTG-3′，目的產物長度為316 bp；異構體DLX7引物序列：上游5′-TTATGAAACTGTCCGTCCTACC-3′，下游5′-TGT GCTGGAAACGCTGGT-3′，目的產物長度為201 bp；選取ABL1作為內參基因，ABL1引物序列：上游5′-TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA-3′，下游5′-TCC AACGAGCGGCTTCAC-3′，引物由上海華大基因公司合成。通過AceQ qPCR SYBR Green Master Mix進行RT-qPCR定量檢測異構體BP1及DLX7的表達。RT-qPCR反應在ABI 7300擴增儀上進行，反應條件：預變性95 ℃ 5 min(1個循環)，變性95 ℃ 10 s、退火63 ℃ 30 s(BP1)以及60 ℃ 30 s(DLX7)、延伸72 ℃ 30 s、收集熒光80 ℃ 30 s(40個循環)。異構體BP1及DLX7相對表達量計算方法參考文獻報道[11]。

1.2.3亞硫酸鹽處理及MSP法檢測異構體BP1啟動子甲基化 取gDNA 1 μg，采用EpiTech Bisulfite Kit(Qiagen公司，德國)試劑盒參照說明書進行硫化修飾，修飾后的標本置于-80 ℃保存備用。異構體BP1啟動子甲基化MSP引物序列：甲基化上游5′-TAGATCGGTTTGGAGTATGC-3′，甲基化下游5′-AACGTCCCGAATTAACTACC-3′；未甲基化上游5′-AGGTAGATTGGTTTGGAGTATGT-3′，未甲基化下游5′-TTAAACATCCCAAATTAACTACC-3′，甲基化及未甲基化目的產物長度均為131 bp。通過EpiTaq HS(for bisulfite-treated DNA)(Takara公司，日本)進行MSP定性檢測BP1啟動子甲基化態勢。MSP反應條件：預變性98 ℃ 10 s(1個循環)，變性98 ℃ 10 s、退火59 ℃ 30 s以及60 ℃ 30 s(DLX7)、延伸72 ℃ 30 s、酶滅活72 ℃ 7 min(40個循環)。MSP產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.2.4BSP法檢測異構體BP1啟動子甲基化 異構體BP1啟動子甲基化BSP引物序列：上游5′-GG GAGATTGTAAATGTAGATTTTTTG-3′，下游5′-AT ACCCCCCATAACTTTCCC-3′，目的產物長度均為415 bp，含有27個CpG位點。通過EpiTaq HS(for bisulfite-treated DNA)(Takara公司，日本)進行BSP定性擴增BP1啟動子。BSP反應條件：預變性98 ℃ 10 s(1個循環)，變性98 ℃ 10 s、退火59 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s、酶滅活72 ℃ 7 min(40個循環)。BSP產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳驗證并切膠回收，并使用AxyPrep DNA Gel Recovery Kit(Axygen公司，美國)純化。純化后產物通過pMD 19-T Vector Kit(Takara公司，日本)連接，后導入DH5α感受態細胞(Vazyme公司，中國)克隆。最后選擇至少10個單克隆送華大基因公司行Sanger法測序。

1.3 統計學分析采用SPSS 22.0及GraphPad Prism 5.0軟件進行統計學分析。兩組連續性變量間的差異分析使用Mann-WhitneyU檢驗，分類變量之間的差異分析采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。DLX4表達在AML中的診斷價值采用ROC曲線及ROC曲線下面積(AUC)進行評價。采用Kaplan-Meier法進行生存分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AML患者及細胞株中DLX4基因異構體的表達RT-qPCR檢測37例對照組中異構體BP1表達的平均水平為0.028(中位值0，范圍0～1.000)，153例AML患者中異構體BP1表達的平均水平為0.324(中位值0，范圍0～8.905)，與對照組相比，異構體BP1在AML中表達上調，差異有顯著性(P<0.001，圖1A)。此外，7例AML細胞株和1例慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)急粒變細胞株中BP1表達水平比對照組平均水平(0.028)均有不同程度增高(圖1B)。

37例對照組中異構體DLX7表達的平均水平為1.234(中位0.265，范圍0.012～7.804)，153例AML患者中異構體DLX7表達的平均水平為0.275(中位0.008，范圍0～6.150)，異構體DLX7在AML中表達比對照組下調(P<0.001，圖1C)。此外，7例AML細胞株和1例CML急粒變細胞株中DLX7表達水平比對照組平均水平(1.234)均有不同程度降低(圖1D)。

圖1 AML患者及細胞株中DLX4各異構體的表達水平：A.異構體BP1在AML患者中的表達；B.異構體BP1在AML細胞株中的表達；C.異構體DLX7在AML患者中的表達；D.異構體DLX7在AML細胞株中的表達

2.2 DLX4基因異構體啟動子CpG島在AML患者及細胞株中的甲基化態勢為進一步探索DLX4異構體差異性表達的影響因素，對DLX4基因結構進行分析，發現DLX4兩個異構體BP1和DLX7前啟動子區域均存在較大的CpG島(圖2A)。本組前期實驗結果發現AML及CML患者中異構體DLX7啟動子CpG島存在高甲基化現象，并且可能影響異構體DLX7表達導致其表達下調[12-13]。本實驗首先通過MSP法對AML細胞株進行檢測，發現7例AML細胞株和1例CML急粒變細胞株均呈完全未甲基化態勢(圖2B)。隨機選擇2例AML細胞株通過BSP法亦證實其低甲基化狀態(圖2B)。另實驗還通過MSP法對AML進行檢測，結果亦發現AML均呈完全未甲基化態勢，7例AML患者代表性結果詳見圖2C。隨機選擇8例AML通過BSP法亦證實其低甲基化狀態(圖2C)。

圖2 DLX4基因結構模式圖及BP1啟動子區域CpG島在AML中的甲基化態勢：A.DLX4基因結構模式圖；B.AML細胞株中BP1啟動子區域CpG島甲基化態勢，其中1～8分別為K562、SHI-1、U937、THP-1、NB4、HL60、HEL、NB4，9為未甲基化質控，10為甲基化質控，11為雙陰性質控，BSP散點圖為HL60及THP-1細胞株；C.AML患者中BP1啟動子區域CpG島甲基化態勢，其中1～7為隨機挑選的7例AML，8為未甲基化質控，9為甲基化質控，10為雙陰性質控；BSP散點圖為隨機挑選的8例AML患者

2.3 DLX4基因異構體表達的鑒別診斷意義采用ROC曲線評估DLX4異構體表達是否可作為AML診斷的潛在分子標志，結果發現異構體BP1表達可用于鑒別實驗組和對照組的參考標志(AUC=0.699，95%CI：0.619～0.779，P<0.001，圖3A)。異構體DLX7表達更能用于鑒別實驗組和對照組的參考標志(AUC=0.834，95%CI：0.776～0.893，P<0.001，圖3B)。此外，為進一步明確BP1及DLX7表達聯合在AML中的潛在診斷價值，實驗進一步通過Logistic回歸分析擬合新變量，同時通過ROC曲線分析發現，異構體BP1及DLX7表達聯合用于鑒別實驗組和對照組的效能更為有價值(AUC=0.883，95%CI：0.821～0.945，P<0.001，圖3C)。

圖3 AML患者中DLX4各異構體表達的ROC分析：A.AML患者中異構體BP1表達的ROC分析；B.AML患者中異構體DLX7表達的ROC分析；C.AML患者中異構體BP1和DLX7聯合表達的ROC分析

2.4 DLX4基因異構體表達與AML臨床及實驗室參數的相關性選取使ROC曲線的敏感度、特異性最優的異構體BP1表達水平(0.007)(敏感度為46.4%，特異性為97.3%)及DLX7表達水平(0.012)(敏感度為52.9%，特異性為100%)為臨界值。針對異構體BP1，高表達組和低表達組在患者性別、年齡、血小板計數、血紅蛋白含量、骨髓原始細胞比例及核型危險度分組中差異均無顯著性(P>0.05)，但異構體BP1高表達組患者的白細胞計數顯著高于異構體BP1低表達組(P=0.001)。此外，兩組患者在FAB分型分布上差異有顯著性(P=0.021)。在基因突變中，異構體BP1高表達組患者FLT3-ITD突變率顯著高于異構體BP1低表達組患者(P=0.039，表1)。

針對異構體DLX7，高表達組和低表達組在患者性別、年齡、白細胞計數、血小板計數、血紅蛋白含量、骨髓原始細胞比例、FAB分類、核型危險分組、基因突變中差異均無顯著性(P>0.05，表1)。

2.5 DLX4基因異構體表達與AML患者預后的相關性實驗分析了DLX4異構體表達與患者接受誘導化療后完全緩解率的關系(隨訪130例)。異構體BP1過表達患者完全緩解率低于異構體BP1高表達組患者，僅在非M3組患者中差異有顯著性(P=0.047)；異構體DLX7高低表達組患者之間差異無顯著性(P>0.05，表1)。

表1 AML患者中DLX4各異構體表達與臨床病理特征的關系

Kaplan-Meier法進一步分析DLX4異構體表達對患者生存的影響(隨訪130例)。異構體BP1高表達患者總生存期低于異構體BP1低表達患者，在非M3患者及正常核型AML患者中差異有顯著性(P=0.007、0.035，圖4)。因異構體BP1高表達和FLT3-ITD突變有相關性，且FLT3-ITD過表達提示患者預后不良。實驗剔除FLT3-ITD突變患者，通過生存分析進一步證實異構體BP1過表達對患者預后不良的影響(P=0.004、0.024，圖4)。異構體DLX7通過生存分析發現：無論是全部AML、非M3 AML及正常核型AML中，兩組之間差異均無顯著性(P>0.05，圖4)。

圖4 AML患者中DLX4各異構體表達對患者預后的影響

3 討論

越來越多的報道揭示DLX4基因在腫瘤發生、發展過程中起重要作用。如Zhang等[14]報道DLX4可以通過上調TWIST促進上皮-間充質轉化從而促進乳腺癌細胞侵襲及轉移。此外，亦有報道證實DLX4異構體BP1通過促進細胞增殖及侵襲參與ER-乳腺癌的發生、發展[15]。Haria等[16]研究結果顯示，DLX4可以通過刺激NF-κB活性誘導CD44表達促進卵巢癌的轉移。此外，敲減DLX4表達可促進絨毛膜癌細胞的凋亡[17]。Ling等[18]研究發現，DLX4可上調YB-1影響細胞增殖、周期及侵襲，參與鼻咽癌的形成。臨床相關研究結果亦證實DLX4或異構體BP1在腫瘤中的表達與患者預后密切相關，并且可能作為預后判斷的分子標志物[19-21]。綜合以上結果揭示，DLX4在腫瘤發生、發展中起促癌作用。然而，亦有較多研究發現DLX4在腫瘤中存在高甲基化現象，并且與預后密切相關[22-23]，這些結果提示DLX4可能扮演抑癌作用，其與之前報道DLX4發揮促癌作用結論矛盾。對DLX4的基因結構進行分析發現，DLX4基因存在2個異構體，CDS較長者稱之為BP1，CDS較短者稱之為DLX7，而多數報道并未嚴格區分兩者。本實驗分別設計2個異構體的特異性引物在AML患者及細胞株中的表達進行檢測，結果發現異構體BP1在AML中呈過表達態勢，與先前報道一致[24]。然而，異構體DLX7在AML中呈低表達態勢，既往未見相關報道。針對DLX4的2個異構體功能，擬進一步實驗證實。此外，本實驗進一步分析了DLX4的2個異構體表達的臨床意義，ROC曲線分析揭示異構體BP1及DLX7表達，尤其是兩者聯合變量，可能對AML輔助診斷有一定幫助；預后分析揭示BP1過表達與AML患者低緩解率及低生存期相關，與實體腫瘤報道類似。由于異構體DLX7表達與AML患者預后無相關性，因此異構體BP1在AML形成中可能扮演促癌作用，異構體DLX7可能扮演抑癌作用，并且異構體BP1過表達可能作為AML患者預后判斷的生物學標志物。

甲基化作為最為常見的表觀遺傳學方式之一，在調控基因表達方面起重要作用。鑒于已有文獻報道揭示DLX4存在高甲基化現象，同時DLX4的2個異構體表達態勢相反。本實驗進一步分析DLX4基因結構，發現異構體BP1及DLX7前啟動子區域均有較大的CpG島，既往報道DLX4甲基化研究區域主要是針對異構體DLX7啟動子內CpG島，并且影響基因表達。我們既往通過定量MSP及BSP的方法亦證實AML及CML患者中異構體DLX7啟動子CpG島存在高甲基化現象，并且與DLX7表達呈負相關[12-13]。此外，對異構體DLX7啟動子高甲基化AML細胞株行去甲基化處理可恢復DLX7的表達[12-13]。由此揭示，異構體DLX7在AML中表達下調可能是因為DLX7啟動子CpG島高甲基化所致。本實驗進一步針對AML中異構體BP1啟動子CpG島進行分析，結果發現異構體BP1啟動子CpG島呈完全未甲基化。由此可見，AML中異構體BP1表達上調不是因為BP1啟動子甲基化改變所致。目前已有報道表明實體腫瘤中異構體BP1過表達可能因其基因拷貝數擴增所致[25]。此外，針對其他基因相關研究發現基因啟動子轉錄因子結合位點多態性可能影響基因表達參與AML的發生[26]。然而，AML中異構體BP1過表達原因目前尚不完全明確，有待進一步分析。

綜上所述，AML中DLX4的2個異構體BP1及DLX7表達態勢不同。異構體BP1呈過表達，與其啟動子甲基化無關，可作為AML患者預后不良的生物學標志物；DLX7呈低表達，可能受其啟動子高甲基化影響，與AML患者預后無關。