胃癌組織中miR-107、AXIN2的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性

張肖麗，張月曉，李 萍，李炳慶，陳 健

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。其治療首選手術(shù)切除，部分患者預(yù)后差，易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，病死率高[1]，因此，研究胃癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及與預(yù)后的相關(guān)因素，具有重要意義。微小RNA-107(microRNA-107, miR-107)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。鄒德勝等[2]的研究結(jié)果表明，miR-107在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)水平升高，且與結(jié)直腸癌的TNM分期相關(guān)。趙軻等[3]的研究結(jié)果表明，非小細(xì)胞肺癌組織中miR-107呈高表達(dá)，且與病理分化、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期呈正相關(guān)。軸抑制蛋白2(axis inhibition protein 2, AXIN2)是Wnt/β-catenin信號通路的重要調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡以及腫瘤的發(fā)生等生物學(xué)功能[4]。AXIN2在乳腺癌等多種腫瘤中均有表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[5]。目前，關(guān)于miR-107與AXIN2同時在胃癌中的研究報道不多。本文采用免疫組化SP法檢測miR-107和AXIN2在胃癌組織中的表達(dá)，探討miR-107和AXIN2表達(dá)與胃癌患預(yù)后的關(guān)系，為臨床和病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1月～2017年5月在我院就診并行手術(shù)治療的65例胃癌患者的組織標(biāo)本，同時取相應(yīng)癌旁正常胃黏膜組織標(biāo)本(距癌灶邊緣至少5 cm)作為對照。所有入組病例經(jīng)病理學(xué)診斷，并排除其他系統(tǒng)的惡性腫瘤，術(shù)前均未行任何抗腫瘤治療，每份標(biāo)本的臨床和病理資料均完整。65例患者：TNM分期Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ+Ⅳ期26例；高分化12例，中分化28例，低分化25例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例；侵及漿膜27例，未侵及漿膜38例。術(shù)后對所有患者進(jìn)行電話或門診隨訪，隨訪日期截至2020年5月。本實驗經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒購自大連TAKARA公司。miR-107、AXIN2及內(nèi)參基因U6、β-actin序列設(shè)計引物，由上海生物工程公司合成。AXIN2兔抗人多克隆抗體購自美國Abcam公司，SP、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

1.3.1樣品采集及保存 胃癌及正常胃黏膜組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，用于免疫組化染色。

1.3.2qRT-PCR法檢測胃癌組織中miR-107和AXIN2 mRNA的表達(dá) 取收集的組織標(biāo)本100 mg，研缽研碎后加TRIzol液，按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎胵RT-PCR法檢測miR-107的表達(dá)。miR-107、AXIN2及內(nèi)參基因U6、β-actin，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃，75 s；95 ℃，15 s；60 ℃，35 s；95 ℃，15 s；合計38個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)束后，miR-107和AXIN2 mRNA表達(dá)水平采用2-△△CT分析法進(jìn)行計算。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3免疫組化 免疫組化染色采用SP法，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。石蠟切片二甲苯脫蠟，加熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)，3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，10%山羊血清封閉后，加入AXIN2兔抗人多克隆抗體(稀釋比1 ∶100)，于4 ℃過夜，DAB顯色后蘇木精復(fù)染。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。

1.3.4結(jié)果判斷 顯微鏡下觀察，每例標(biāo)本隨機(jī)觀察5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，計算每個視野陽性細(xì)胞所占百分比。按陽性細(xì)胞數(shù)評分：<10%為0分，11%～30%為1分，31%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；按細(xì)胞染色強(qiáng)度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為2分。將兩項評分結(jié)果相乘：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性()，6分以上為強(qiáng)陽性()。將(+～)視為陽性。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及正常胃黏膜組織中miR-107與AXIN2 mRNA的表達(dá)本組實驗結(jié)果顯示，miR-107在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常胃黏膜組織，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，AXIN2 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁正常胃黏膜組織，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中miR-107和AXIN2 mRNA的表達(dá)水平

2.2 胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中AXIN2蛋白表達(dá)本組實驗結(jié)果顯示，AXIN2蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜(圖1)，胃癌組織中AXIN2蛋白陽性率顯著低于癌旁正常胃黏膜組織(P<0.05，表3)。

圖1 A.AXIN2蛋白在胃癌組織中呈陰性，SP法；B.AXIN2蛋白在癌旁正常胃黏膜組織中呈陽性，SP法

表3 胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中AXIN2蛋白表達(dá)

2.3 胃癌中miR-107和AXIN2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系本組以胃癌組織中miR-107表達(dá)的平均數(shù)，將胃癌患者分為高表達(dá)組(≥1.65)和低表達(dá)組(<1.65)，以AXIN2蛋白免疫組化染色結(jié)果，將胃癌患者分為AXIN2高表達(dá)組(染色結(jié)果為陽性)和AXIN2低表達(dá)組(染色結(jié)果為陰性)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-107、AXIN2表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及浸潤深度有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤大小和病變部位無關(guān)(P>0.05，表4)。

表4 胃癌中miR-107和AXIN2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 miR-107和AXIN2表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系隨訪截至2020年5月31日，術(shù)后隨訪6～36個月，無失訪病例，隨訪期間死于胃腺癌者24例，Kaplan-Meier生存分析顯示，miR-107高表達(dá)者總生存率為24.07%，低表達(dá)者總生存率為64.48%，miR-107高表達(dá)組胃癌患者3年生存率顯著低于低表達(dá)組患者(χ2=8.486，P<0.05，圖2A)。AXIN2高表達(dá)者總生存率為64.39%，低表達(dá)者總生存率為28.73%，AXIN2高表達(dá)組胃癌患者3年生存率顯著高于低表達(dá)組患者(χ2=5.729，P<0.05，圖2B)。

圖2 Kaplan-Meier生存分析：A.miR-107表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系；B.AXIN2表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

2.5 胃癌患者預(yù)后影響因素分析Cox單因素分析結(jié)果顯示，低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、miR-107高表達(dá)、AXIN2低表達(dá)是影響胃癌患者不良預(yù)后的危險因素(P<0.05)。性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤深度與胃癌患者預(yù)后無關(guān)(P>0.05)；多因素分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、miR-107高表達(dá)、AXIN2低表達(dá)是影響胃癌患者不良預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05，表5)。

2.6 胃癌組織中miR-107和AXIN2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性胃癌組織中miR-107和AXIN2 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.607，P<0.001，圖3)。

圖3 胃癌組織中miR-107和AXIN2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，隨著醫(yī)療水平的提高，胃癌的診治水平有不同程度地提高，但部分患者的預(yù)后情況和生活質(zhì)量卻未得到有效改善，因此早期預(yù)判胃癌患者的預(yù)后，尋找胃癌有效的生物學(xué)靶點具有重要意義[6-7]。

miR-107在細(xì)胞的生長、分化、增殖、發(fā)育、凋亡和代謝等多種過程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)失衡與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，可作為疾病診斷的分子標(biāo)志物[8-9]。余南榮等[10]的研究結(jié)果表明，miR-107在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，可通過靶向Notch2促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。于志紅等[11]的研究結(jié)果表明，miR-107在胃癌組織中高表達(dá)，miR-107可通過負(fù)向調(diào)控PCDH17促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力。本實驗結(jié)果顯示，在胃癌組織中miR-107表達(dá)水平高于癌旁正常胃黏膜組織，其表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及浸潤深度有關(guān)，提示miR-107在胃癌的發(fā)展過程中可能發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲的作用，進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，miR-107高表達(dá)組胃癌患者3年生存率顯著低于低表達(dá)組患者，提示miR-107高表達(dá)可能增強(qiáng)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲能力，調(diào)控腫瘤發(fā)展進(jìn)而影響患者預(yù)后情況。

AXIN2作為一種信號調(diào)控因子，與多種腫瘤，如肝癌、結(jié)腸癌、肺癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[12]。張濤等[13]的研究結(jié)果表明，胰腺癌細(xì)胞株中AXIN2的表達(dá)與正常胰腺細(xì)胞相比表達(dá)下調(diào)，在侵襲能力越高的癌細(xì)胞株中表達(dá)越低，提示起抑癌基因作用。本實驗結(jié)果顯示，胃癌組織中AXIN2蛋白陽性率顯著低于正常胃黏膜組織，進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，低分化胃癌組織中AXIN2表達(dá)水平顯著低于中+高分化者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的AXIN2表達(dá)水平顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期者的AXIN2表達(dá)水平顯著低于Ⅰ+Ⅱ期者，侵及漿膜者的AXIN2表達(dá)水平顯著低于未侵及漿膜者，提示AXIN2與胃癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。生存分析顯示，AXIN2高表達(dá)組胃癌患者3年生存率顯著高于低表達(dá)組患者，提示AXIN2表達(dá)缺失的患者腫瘤分化差、預(yù)后差，易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，AXIN2可能通過調(diào)控腫瘤發(fā)展影響患者預(yù)后。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、miR-107高表達(dá)、AXIN2陰性是影響胃癌患者不良預(yù)后的獨立危險因素，提示miR-107、AXIN2可能作為評估胃癌患者不良預(yù)后的生物標(biāo)志物。然而兩者在胃癌中的表達(dá)關(guān)系及具體作用機(jī)制尚不清楚，Zhang等[14]研究結(jié)果表明，miR-107在肝癌組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào)，AXIN2的表達(dá)受miR-107負(fù)調(diào)控，miR-107可以通過靶向AXIN2促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。本實驗結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-107與AXIN2表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，因此本實驗推測miR-107可能靶向作用于AXIN2促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，共同參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，胃癌組織中miR-107高表達(dá)，AXIN2低表達(dá)，且與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、浸潤深度和患者預(yù)后有關(guān)，可能作為胃癌患者預(yù)后評估的分子標(biāo)志物。但兩者在胃癌中的具體作用機(jī)制仍需擴(kuò)大樣本量深入探討。