清肝利水方對慢性高眼壓大鼠眼壓的影響

陳夢婷，董志國，張殷建

青光眼作為全球第二位致盲性眼病，若不加以治療，最終可導致失明[1]。目前全球約有7,600 萬青光眼患者，其中失明患者約為1,120 萬[2]，預計到2040年青光眼患者可能會增至1.118 億[3]，嚴重影響患者的生活質量。眼壓升高是青光眼的主要危險因素。雖然眼壓升高的機制還未完全清楚，但可以通過藥物或手術降低眼壓以減緩青光眼造成的視神經損害。目前，眼科學者一直對治療青光眼新藥進行研究，探尋眼壓升高的機理以尋找新的治療藥物。另外，某些中藥也具有降低眼壓的作用，為青光眼的治療提供了更多選擇[4]。清肝利水方是上海市名老中醫、眼科專家鄒菊生的經驗方，經多年臨床應用，具有良好的療效，課題組前期臨床研究[5]證實本方在原發性開角型青光眼（primary open-angle glaucoma，POAG）患者視力、視野平均敏感度及全身癥狀改善方面均有很好的療效，還有協同降低眼壓的作用。為驗證清肝利水方降低眼壓的作用，采用SD 大鼠進行實驗性眼壓升高的造模，并進行相關的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗選用6～8 周齡清潔級健康雄性SD 大鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005）48 只，體重（150±30）g，所有大鼠毛發色澤光亮，眼外觀、眼壓均正常。飼養于復旦大學動物實驗中心，在獨立換氣系統的籠具中，4 只/籠，溫度維持在21℃左右，12 h 光/暗循環照明，常規飼料飼養，給予充足的水和活動空間。相關實驗操作均符合動物倫理及動物中心相關管理辦法。實驗結束后腹腔注射25%烏拉坦（8 ml/kg）將大鼠處死。

1.2 試劑與儀器

水合氯醛（國藥集團工業股份有限公司）；烏拉坦（國藥集團工業股份有限公司）；0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液（日本參天制藥有限公司，批號：JX20160077）；復方托吡卡胺滴眼液（日本參天制藥有限公司，批號：J20180051）；氧氟沙星眼膏（沈陽興齊制藥有限公司，批號：H10940177）；鹽酸左布諾洛爾滴眼液（ALLERGAN 艾爾建有限公司，批號：H20130765）；超順磁性氧化鐵磁珠（superparamagnetic iron oxide，SIO）（美 國Bangs Laboratories 公司）；OPMI VISU 顯微鏡（德國蔡司公司）；微量注射器（上海高鴿工貿有限公司）；手持式數字眼壓計（Tonopen XL）（美國Medtronic Solan 公司）；一次性注射器（常州雙馬醫療器材有限公司）；顯微手術器械（蘇州六六視覺科技公司）。

10%水合氯醛：取5 g 水合氯醛，加0.9%氯化鈉溶液定容至50 ml，現用現配。25%烏拉坦：取25 g 烏拉坦，加0.9%氯化鈉溶液定容至100 ml，現用現配。

1.3 清肝利水方煎劑的制備

清肝利水方藥物組成為：夏枯草12 g、葛根15 g、車前子15 g、枸杞子12 g。本方生藥購于上海中醫藥大學附屬龍華醫院中藥房，由上海華宇藥材有限公司提供，均為道地藥材，由上海中醫藥大學生藥研究教研室專職員工進行藥材評估。

制備方法：加入7 倍生藥重量的水沸騰煎煮2次后，將所有水煎劑混合并蒸發濃縮至最終濃度為1 g/ml。將制備好的中藥儲存于-20℃備用。使用時按所需濃度加入大鼠飲用水中稀釋，注意所有大鼠灌胃同等體積中藥溶液，2 ml/d。

1.4 方法

1.4.1 造模 所有大鼠適應性飼養3 d 后進行造模。通過眼前房注射SIO 術建立穩定的慢性高眼壓大鼠模型，參考Paulina A[6]、Chen YQ[7]、Zhang C[8]的方法對大鼠左眼進行造模。

具體操作方法如下：先將大鼠稱重，用10%水合氯醛溶液進行腹腔注射麻醉，劑量為4 ml/kg，待其無意識后使其身體側臥，暴露左眼于OPMI VISU顯微鏡下；0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液眼表局部麻醉，待術眼角膜反射消失后使用復方托吡卡胺滴眼液進行擴瞳，以減少手術引起的虹膜損傷。先用1 ml一次性無菌注射器針頭在角鞏膜緣刺一小口，以便微量注射器進入。用振蕩器將SIO 振蕩混勻后，用25 μl 微量注射器吸取10 μl SIO 并從角鞏膜緣小口小心穿刺進入前房角后緩慢注入SIO，注射后以小型手持磁鐵（0.45 T）將SIO 吸引至穿刺口另一端后再拔出注射針，以防SIO 經穿刺口外流，再用磁鐵將SIO 均勻分布于眼前房以阻塞小梁網升高眼壓。空白組進行假手術，用0.9%氯化鈉溶液替代SIO，以消除手術操作的影響。術后眼表予氧氟沙星眼膏覆蓋，預防感染。觀察30 min 左右，待大鼠麻醉完全蘇醒后再將其送回飼養室。術后1 周眼壓值持續升高，且與造模前眼壓差異均具有統計學意義（P<0.05）[9]，提示造模成功。

1.4.2 分組與處理 將SD 大鼠隨機分為6 組，空白組、模型組、中藥低濃度組（LCG）、中藥中濃度組（MCG）、中藥高濃度組（HCG）、陽性對照組（PG），每組8 只。中藥低、中、高濃度組予清肝利水方灌胃，濃度分別為3.1 g/kg、6.2 g/kg、12.4 g/kg（按人與動物之間體表面積關系換算得出該水煎劑的正常給藥量為6.2 g/kg，低、高濃度組給藥量為正常給藥量的1/2 和2 倍[10]），空白組、模型組、陽性對照組給予飲用水灌胃，各組劑量相同，每日1 次。除灌胃外，陽性對照組大鼠每日予鹽酸左布諾洛爾滴眼液，其余各組予0.9%氯化鈉溶液滴眼，滴左眼，每日1 次。

1.5 眼壓測定

于造模前及造模后1、3、7、14 d 測量左眼眼壓值，為減小誤差，每次于同一時間段（13:00-15:00）進行測量，測量時按造模方法將大鼠全麻和局麻，使用手持式數字眼壓計進行連續5 次測量，取數值偏差小于5%的平均值作為眼壓值[7]。

1.6 統計學方法

使用SPSS 21.0 統計軟件對數據進行分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，運用單因素方差分析（ANOVA）進行多組間比較，運用LSD-t 檢驗進行兩兩比較，當P＜0.05 時，認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠實驗入組情況

剔除造模失敗及后續產生眼底出血、白內障等并發癥的大鼠，各組入組大鼠：空白組8 只、模型組6 只、中藥低濃度組7 只、中藥中濃度組7 只、中藥高濃度組6 只、陽性對照組6 只。

2.2 各組造模前后眼壓變化

空白組假手術后均穩定在10 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）左右。其余各組注射SIO 后第1 d 起眼壓均有升高，其中模型組持續升高。用藥后，中藥中濃度組、陽性對照組眼壓下降最快，第7 d 開始持續下降，直至第14 d，陽性對照組眼壓最低。

造模后，模型組眼壓均高于空白組（t1d=22.259，t3d=19.065，t7d=10.545，t14d=11.204，均P=0.000）。造模后7 d，中藥中濃度組眼壓低于中藥低、高濃度組，差異均有統計學意義（tLCG=58.106，tHCG=30.370，P=0.000）。各治療組與模型組相比，差異均無統計學意義（P＞0.05）；陽性對照組與中藥各濃度組相比，差異均無統計學意義（P＞0.05）。造模后14 d，各治療組眼壓均低于模型組（tLCG=20.981，tMCG=14.570，tHCG=18.737，tPG=11.539，均P=0.000）；與陽性對照組相比，中藥各濃度組眼壓均升高，差異均有統計學意義（tLCG=6.671，tMCG=6.570，tHCG=5.279，均P=0.000）。中藥各濃度組間眼壓差異無統計學意義（P>0.05）（表1）。

表1 各組左眼在不同時間點的眼壓值（，mm Hg）

表1 各組左眼在不同時間點的眼壓值（，mm Hg）

注：# 與空白組比較，P<0.05；* 與模型組比較，P<0.05；&與陽性對照組比較，P<0.05；a 與低濃度組比較，P<0.05；b 與高濃度組比較，P<0.05

3 討論

青光眼以病理性眼壓增高為主要特征，隨著病情進展，視力逐漸下降并伴有視野缺損，最終導致失明[1]。高眼壓壓迫視神經纖維和鞏膜，可導致視神經軸突萎縮，軸漿流受阻，視網膜神經節細胞（retinal ganglion cells，RGC）的營養供應不足，進一步引發視神經纖維的病變。并且高眼壓可通過激活線粒體凋亡信號通路以及阻礙神經營養因子受體復合物的逆運輸等引起視網膜神經節細胞的凋亡[11]。

本次慢性高眼壓動物模型，沿用課題組前期的造模方法[8]，采用SIO 眼前房注射以阻塞小梁網達到眼壓升高的效果。經前期實踐這種造模方法操作相對簡便、成功率高，且升高眼壓效果可維持4 周以上。本次實驗SIO 注射量為10 μl，造模后眼壓增高明顯，說明此注射量有利于高眼壓大鼠模型的更快建立。

臨床上治療青光眼以降眼壓為主，可以有效控制一部分青光眼患者視野缺失，減緩視神經萎縮以及緩解眼部不適癥狀，但降眼壓眼藥水帶來的諸如眼干澀、結膜充血等副作用明顯，并且部分患者在降眼壓治療處理后仍無法阻止視野及視盤損害[1,11]。中醫藥在慢性青光眼的治療中有一定優勢，越來越受到重視。清肝利水方是名老中醫鄒菊生教授治療青光眼的臨床經驗方，鄒老認為本病病位在肝，病機是情志不暢致肝失疏泄，日久肝郁氣滯而化火，肝火上擾于目，致使目中脈絡阻滯，玄府郁閉，神水滯留，運行不暢而導致眼脹、視物膜糊，久則損害目系[12]，故創立本方，方中夏枯草、葛根清肝瀉火為君藥，車前子利水為臣藥，枸杞子補肝腎明目為佐藥，全方共筑清肝利水明目之效。課題組在臨床研究[5]中，觀察到針對肝郁氣滯型POAG 患者，試驗組采用清肝利水方聯合降眼壓滴眼液，對照組只使用降眼壓滴眼液，治療后試驗組總有效率高于對照組，且在視力、平均敏感度及全身癥狀改善方面均優于單純西藥組，證實清肝利水方可改善青光眼患者臨床癥狀，提高生活質量。

本研究造模成功并經清肝利水方干預后，中濃度組、陽性對照組眼壓下降最快，第7 d 開始持續下降，直至第14 d，陽性對照組眼壓最低，且各濃度組較模型組明顯下降。通過實驗發現中藥降眼壓效果與濃度有關，推測低濃度組由于中藥濃度過低，在短時間給藥后藥效不夠阻止眼壓的進一步升高，因此降眼壓效果較差；高濃度組在造模后早期有較好的降眼壓效果，而后期效果不如中濃度組，推測清肝利水方的降眼壓效果與給藥濃度并非完全呈正相關，而是達到一定給藥濃度才能發揮較好的降眼壓效果；中濃度組為計算后的標準給藥劑量，在給藥第7 d相對低、高濃度組降眼壓效果更優。

現代藥理學已驗證了清肝利水方中的幾味中藥治療眼病的藥理作用。例如葛根的提取物葛根素是異黃酮化合物，已廣泛應用于青光眼的臨床治療[13]，夏枯草以及夏枯草醇提物可以抑制眼內一氧化氮（NO）的含量抑制眼病中的炎癥反應和疼痛[14]，車前子可以抑制過量的過氧化氫（H2O2）生成引起的晶狀體上皮細胞的凋亡，具有抗氧化的能力[15]。枸杞子在高眼壓動物模型中已驗證對RGC 具有保護作用，其療效可能與結晶蛋白的上調有關[16]。清肝利水方降低眼壓的作用可能涉及血管、軸突病變、免疫、氧化應激、自噬、細胞因子等多種機制，是清肝利水方中的哪些有效成分發揮主要作用，以及具體作用機理及機制將是進一步研究的方向。