HPLC法測定不同種類水果中的花青素含量

白沙沙 呂品鑫 顧海華 喬子純 孔凡華 唐洪濤 崔亞娟 李東

摘?要：建立了水果中飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素和錦葵色素等6種花青素含量的高效液相色譜測定方法，并對該方法的線性、精密度、回收率、穩(wěn)定性進行了方法學驗證。利用本方法測定了10種水果中6種花青素含量，結(jié)果表明：強酸溶液提取并水解得到花青素的處理方式穩(wěn)定好、精密度高、回收率好，液相條件分離效果好，定量準確度高。10種水果測定結(jié)果表明，不同種類水果中花青素含量差異顯著，花青素總量高的水果中6種花青素單體的含量差異顯著，且不同種類水果中優(yōu)勢花青素單體不同。

關(guān)鍵詞：水果;花青素;高效液相色譜法

目前已經(jīng)確定的花色苷及花青素已有250多種，其中存在較普遍的有6類：飛燕草色素及其糖苷、矢車菊色素及其糖苷、矮牽牛色素及其糖苷、天竺葵色素及其糖苷、芍藥素及其糖苷、錦葵色素及其糖苷[1-3]。花青素類基本結(jié)構(gòu)為3，5，7-三羥基-2-苯基并吡喃，其鄰苯二酚結(jié)構(gòu)和多個羥基特性呈現(xiàn)出抗氧化、抗惡性腫瘤和抗炎等多種生理活性[4-7]。廖艷艷等[8]利用動物實驗驗證了藍莓花青素對老齡大鼠的抗氧化效果和肝臟保護作用，證明了藍莓花青素可以減少機體活性氧物質(zhì)的積累并抑制凋亡基因的過度表達。Traustadóttir等[9]利用雙盲隨機安慰劑對照服用花青素的老年受試者研究結(jié)果表明，花青素可以降低缺血再灌注損傷誘導的血漿中F2-異前列腺素濃度和尿液中氧化核酸的分泌，提高老年人的抗氧化能力。

目前花青素的測定方法主要有分光光度法[10-12]、高效液相色譜法[13]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]。分光光度法又分為單一pH值測定方法和pH值示差法。高效液相色譜法測定花青素含量目前有農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《植物源性食品中花青素的測定高效液相色譜法 NY/T 2640—2014》，本方法是采用酸性乙醇溶液提取花青素和花色苷，沸水浴條件下水解花色苷為花青素，采用高效液相色譜儀對6種花青素進行分離后定性定量測定，其中各種花青素的有效分離是測定的關(guān)鍵點，所以本類方法在花青素分析種類上不具有優(yōu)勢。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法在一定程度上彌補了液相方法的不足，通過液相條件的分離，母離子和子離子的定性定量測定，提高了目標物測定的靈敏度，可以同時測定幾十甚至上百種化合物，在花青素和花色苷的測定中具有一定優(yōu)勢。本試驗采用農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《植物源性食品中花青素的測定高效液相色譜法 NY/T 2640—2014》研究不同水果中的花青素含量，為水果的消費和綜合利用提供數(shù)據(jù)支持。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

1.1.1?水果樣品采集與制備?（1）樣品采集：本試驗選擇北京地區(qū)商超和農(nóng)貿(mào)市場，通過現(xiàn)場采集和網(wǎng)購方式共收集到水果10種。（2）樣品制備：采用四分法取樣，每種水果進行可食部分離后，于高速勻漿機中勻漿處理。

1.1.2?主要試劑?（1）無水乙醇：色譜純，F(xiàn)isher公司;甲酸：色譜純，F(xiàn)isher公司;甲醇：色譜純，F(xiàn)isher公司;鹽酸：優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司。（2）提取液：按照體積比進行配置，無水乙醇∶水∶鹽酸=2∶1∶1。（3）飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素和錦葵色素標準品：純度96%，SIGMA-ALDRICH公司。（4）標準溶液的配置：準確稱取各標準品并用10%甲酸甲醇溶液溶解定容，得到6種單標儲備液。（5）混合標準工作液：分別移取6種單標儲備液，稀釋并定容，制備混標中間液，由混標中間液制備濃度為0.2～4 μg/mL的混合標準工作液。

1.2?儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：二極管陣列檢測器，日立;電子天平：感量0.000 1 g和0.01 mg，Sartorius公司;超聲波清洗儀：SPCC-80A，東莞譜標;恒溫水浴鍋：ZHWY-110X30，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3?花色苷的提取

根據(jù)水果樣品可食部顏色，適當稱取一定量的水果勻漿于50 mL具塞三角瓶中，加入35 mL提取液，充分搖勻，超聲提取30 min。

1.4?花色苷水解

提取完成后，置于沸水浴中水解1 h，取出后冷卻，用提取液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中并定容，此步驟是將花色苷水解為花青素，搖勻后靜止，取上層清夜過0.45 μm濾膜，備用。

1.5?儀器測定與計算

采用250 mm*4.6 mm，5 μm的C18色譜柱進行分離，流動相為1%甲酸水溶液和1%甲酸乙腈溶液梯度洗脫，檢測波長530 nm，柱溫35 ℃，進樣量為10 μL，梯度洗脫條件見表1。混合標準工作液和樣品制備溶液分別注入高效液相色譜儀進行分離和測定，以峰面積和對應(yīng)濃度做標準工作曲線，外標法定量。

1.6?數(shù)據(jù)分析

利用Excel和SPSS分析軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?6種花青素單體標準曲線

以花青素標準工作液濃度為橫坐標、儀器測定峰面積為縱坐標，得到工作曲線見表2。由圖1可知，6種花青素單體的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995，在測定范圍內(nèi)可以滿足檢測需要。

2.2?樣品測定精密度

選擇藍莓樣品和紅顏草莓樣品進行6次平行測定，考察本方法的樣品測定精密度，結(jié)果顯示，藍莓樣品中天竺葵色素未檢出，飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、芍藥色素和錦葵色素的樣品測定精密度RSD在3.46%～8.96%之間;紅顏草莓樣品中只檢測到矢車菊色素和天竺葵色素，樣品精密度RSD分別為3.34%和2.77%（表3）。這兩種樣品檢測結(jié)果包含6種花青素單體，本方法前處理和液相條件測得藍莓樣品和紅顏草莓樣品精密度結(jié)果良好，適于水果中花青素的測定。

2.3?加標回收率結(jié)果

采用分析純淀粉為空白底物，分別進行3個水平的加標測定，每個加標水平進行3個平行測定，驗證本方法的加標回收率。表4可知，6種花青素單體的不同加標水平回收率在94.97%～116.50%之間，平行測定RSD為0.55%～8.97%，方法加標回收率良好，能夠滿足花青素含量測定的需要。

2.4?穩(wěn)定性測定結(jié)果

為考察各花青素單體的穩(wěn)定性，選取同一個樣品上機小瓶在檢測序列中每4 h測定1次，共進行6次測定，計算24 h內(nèi)各花青素單體峰面積相對偏差，結(jié)果顯示，避光常溫放置條件下，各花青素單體穩(wěn)定性良好，6種單體中矮牽牛色素6次測定峰面積相對偏差最大，為2.12%，各花青素單體具有很好的穩(wěn)定性（表5）。

2.5?水果中花青素含量的測定

采集北京市場上10種具有顏色的水果，利用所建立的高效液相色譜法測定可食部中花青素含量，結(jié)果顯示，10種水果中有藍莓、黑桑葚、玫瑰香黑提、紅顏草莓、冰鮮楊梅、櫻桃共6種水果中均測定出了花青素含量，其中藍莓花青素中的優(yōu)勢單體為矢車菊色素和芍藥色素，黑桑葚和櫻桃花青素中的優(yōu)勢單體為矢車菊色素，玫瑰香黑提花青素中的優(yōu)勢單體為錦葵色素，紅顏草莓花青素中的優(yōu)勢單體為天竺葵色素。表6表明，黑桑葚花青素中含量最高的矢車菊色素結(jié)果為2 209 mg/kg，飛燕草色素含量僅為2.32 mg/kg，矢車菊色素和飛燕草色素含量相差近1 000倍，矮牽牛色素和天竺葵色素在黑桑葚中未測出。6種水果中均具有1種或2種優(yōu)勢花青素單體，6種花青素單體在此次采樣的10種水果里并未同時檢測出。在未測出的4種水果中，其呈色物質(zhì)應(yīng)為非花青素成分。黑美人西瓜和紅麒麟西瓜果肉中未測定出花青素含量，與文獻報道西瓜中呈色物質(zhì)主要為番茄紅素和β-類胡蘿卜素結(jié)果一致[16];紅肉火龍果果肉中的呈色物質(zhì)為甜菜苷類[17];千禧圣女果中的呈色物質(zhì)為番茄紅素，屬于類胡蘿卜素[18]。

3?結(jié)論

強酸溶液提取并水解得到花青素的處理方式，能夠很好地得到6種花青素單體的總量。方法學驗證結(jié)果顯示，藍莓和紅顏草莓6種花青素單體測定精密度RSD分別為3.46%～8.96%、2.77%和3.34%，結(jié)果均小于10%;不同水平加標回收率結(jié)果為6種花青素單體的不同加標水平回收率在94.97%～116.50%之間，平行測定RSD為0.55%～8.97%，能夠滿足樣品中花青素含量測定的要求;液相條件分離效果好，定量準確度高，24 h內(nèi)各花青素穩(wěn)定性RSD小于2.12%;10種水果花青素含量差異大，6種花青素單體在10種水果中未同時檢出，不同種類水果中優(yōu)勢花青素單體不同。其中，黑美人西瓜、紅麒麟西瓜、紅肉火龍果和千禧圣女果中并未檢測出花青素含量。

4?討論

花青素賦予水果豐富多彩的顏色，使水果呈現(xiàn)藍色、紅色、紫色等色彩。藍莓、黑桑葚、紅顏草莓等漿果類水果中花青素含量豐富，但并不是所有水果中的顏色均是花青素的作用，本研究中紅色西瓜果肉、紅肉火龍果果肉和圣女果中未檢測到飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、芍藥色素和錦葵色素。本研究對10種水果中花青素含量的測定結(jié)果可以為消費者選購富含花青素的水果提供指導，為富含花青素水果的深加工和副產(chǎn)物利用提供科學依據(jù)。

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