NF90在卵巢癌組織中的表達及對SKOV-3血管生成的影響

張文倩 華媛媛 范 靈 凌 麗 熊正愛 曾倩茹

(重慶醫科大學附屬第二醫院婦產科 重慶 400010)

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤[1]，易復發和轉移，由于卵巢位于盆腔深處，多數患者確診時已為晚期，5年生存率僅30-40%，患者預后差。結合靶向治療的綜合治療卵巢癌是目前研究熱點之一，血管生成在腫瘤發生發展的重要作用及抗血管生成治療得到極大關注。卵巢腫瘤細胞生長、轉移和復發都依賴于新生血管生成提供養料和氧氣。缺氧、血管損傷、促血管生成因子等多種因素誘發血管生成，其中缺氧是血管生成的關鍵驅動力[2]。缺氧環境下缺氧誘導因子1-α（hypoxia inducible factor 1α， HIF-1α）轉錄活性增強，誘導腫瘤細胞和腫瘤相關基質細胞生成多種促血管生成因子，如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）家族尤其是VEGF-A、VEGFR2、血管生成素2（angiopoietin 2， ANGPT2）[2]等，VEGF-A除在腫瘤血管生成發揮關鍵作用[2]外，還促進腫瘤細胞增值[3]。

核因子90（nuclear factor 90，NF90，也稱為DRBP76和NFAR1）和NF110（也稱為IL3、NFAR2和TCP110）是白細胞介素增強結合因子3（interleukin enhancer binding factor 3，ILF3）差異性剪接生成的主要產物[4][5][6]，分子量分別為90kDa和110kDa。NF90在肝細胞癌[7]、鼻咽癌[5]、宮頸癌[8]、卵巢癌[9]、胃癌[10]等惡性腫瘤中過表達，其作用被廣泛研究，但與卵巢癌血管生成的關系少有報道。本研究探尋NF90在卵巢癌組織中的表達情況，體外實驗驗證敲減NF90對卵巢癌細胞VEGF-A表達的影響，為后期深入研究提供實驗思路。

一、材料與方法

（一）Oncomine檢索ILF3 mRNA在卵巢癌組織表達情況

Oncomine(www.oncomine.org)是目前世界上最大的癌基因芯片數據庫和整合數據挖掘平臺，擁有最全的癌癥突變譜、基因表達數據以及相關的臨床信息，可利于發現新的生物標記物或新的治療靶點。本研究通過檢索“ILF3”分析ILF3 mRNA在包含卵巢癌在內的常見惡性腫瘤組織中的表達情況，從Oncomine數據庫中篩選基因，在本研究中設置檢索條件為：1.Gene： ILF3，2.Analysis Type： Ovarian Cancer vs. Normal Analysis，3.Data Type： mRNA， 4.Over-expression.

（二）Human Protein Atlas檢索ILF3蛋白在卵巢癌組織表達情況

Human Protein Atlas(www.proteinatlas.org)是利用基于抗體的成像、基于質譜的蛋白質組學、轉錄組學和系統生物學技術整合各種人類蛋白質的數據庫。Human Protein Atlas包括組織圖譜、細胞圖集和病理學圖譜，其中，組織圖譜顯示蛋白質跨越人體所有主要組織和器官的分布，細胞圖集顯示蛋白質在單細胞中的亞細胞定位，病理學圖譜顯示蛋白質水平對患者癌癥的患者存活的影響。本研究利用Human Protein Atlas中的組織圖譜檢索ILF3轉錄蛋白（NF90和NF110）在卵巢子宮內膜樣腺癌、漿液性腺癌和正常卵巢組織中的表達情況。

（三）慢病毒構建

攜帶NF90干擾序列基因的重組慢病毒購于漢恒生物有限公司（上海，中國）。其中陰性對照插入的片段scramble為一段亂序不針對任何人或鼠的shRNA，干擾載體為pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro。

（四）細胞培養、構建缺氧模型及慢病毒轉染

人卵巢癌細胞系SKOV-3購于中國科學院細胞庫，細胞采用含10%胎牛血清（Ausbian，澳大利亞）的DMEM高糖培養基（Gibco，美國）培養，培養箱設定為5%CO2、37℃。

取對數期細胞，棄舊培養基，PBS洗滌后加入無血清培養基孵育過夜。次日，棄舊培養基，PBS洗滌后加入CoCl2工作液避光孵育構建化學缺氧模型。

對數期SKOV-3經細胞胰酶常規消化后按1×105個/孔接種于6孔板，常規孵育過夜。次日采用4小時小體積感染法進行慢病毒轉染，即棄原培養基，加入1/2（即500μl）體積無血清培養基稀釋的慢病毒液，同時設立空白對照組，37℃孵育4h后補齊無血清培養基至正常體積（即1ml）。轉染24h后，棄病毒培養基，改為完全培養基，繼續培養。轉染72小時候，熒光顯微鏡觀察慢病毒轉染效率。用puromycin篩選穩轉株，避光孵育，連續篩選2周后得到穩定轉染細胞株，更換為完全培養基繼續擴大培養。同時，收集細胞進行下一步實驗。

（五）Western blot

RIPA裂解液、PMSF和磷酸酶抑制劑按體積比100：1：1充分混勻后裂解細胞并提取細胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后，采用濕轉法200V恒壓轉膜2小時；將含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中室溫封閉2小時；用相應的一抗4℃孵育過夜；TBST洗膜3次后二抗室溫孵育1小時；再次用TBST洗膜3次后進行ECL成像。使用Image lab軟件進行各條帶灰度值的半定量分析，以β-tubulin為參照，計算目的蛋白相對表達量。

（六）細胞上清液中VEGF-A濃度測定

利用ELISA測定卵巢癌細胞上清液中VEGF-A的濃度。步驟為：1.經NF90/shRNA-control（Control）或NF90-shRNA(shNF90)轉染后的SKOV-3細胞用CoCl2缺氧誘導，收集細胞培養基后3000rpm離心20min后收集上清液。根據說明書按上樣—孵育—洗板—加檢測抗體—洗板—加酶標試劑—洗板—顯色—終止—測定OD值。根據OD值計算各組細胞上清液中VEGF-A的濃度，設置濃度調平基準為pg/ml/2×106cell。

（七）統計學方法

服從正態分布的連續性變量以均數±標準差（mean±standa rd）表示。兩組間均數比較行獨立樣本t檢驗（Unpaired Student’s t-tests），多組間均數行單因素方差分析（One-way ANOVA），以α=0.05為檢驗水準，符合方差齊性檢驗組，使用Bonferonni方法分析，不符合方差齊性檢驗者，使用Dunnett’s T3分析，SNK法行事后兩兩比較。p＜0.05為有統計學差異。采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，GraphPad Prism軟件作圖。

二、結果

（一）NF90在卵巢癌組織中表達升高

NF90在Oncomine數據庫中分析NF90在卵巢癌中的表達情況，共納入7個數據集，包含1043個臨床樣本，包括卵巢漿液性腺癌、卵巢透明細胞腺癌、卵巢子宮內膜樣腺癌、卵巢粘液性腺癌和正常卵巢組織的比較。分析發現，NF90在多種卵巢組織中高表達（median rank=2541， P=0.005），分析發現卵巢漿液性腺癌中NF90表達最高（圖1）。在TCGA數據中分析發現在卵巢漿液性現在中ILF3基因表達較正常卵巢組織顯著升高（P=4.39E-9，fold change=1.870，圖2A）?；诖?，進一步檢索Human protein atlas(www.proteinatlas.org)數據庫發現ILF3蛋白在卵巢漿液性腺癌和內膜樣腺癌中強陽性表達，在正常卵巢組織中陰性表達（圖2B），與Oncomine數據庫的分析結果一致。

圖1 Oncomine數據庫中NF90在卵巢癌組織中的表達的meta分析Fig.1 The meta-analysis of the expression of NF90 in ovarian cancer in the Oncomine database

圖2 NF90和NF110在卵巢癌組織中過表達Fig.2 NF90 and NF110 are upregulated in human ovarian cancer specimens

（二）缺氧環境下NF90與VEGF-A蛋白表達具有相關性

VEGF-A是血管生成的金標準之一，本研究采取VEGF-A蛋白表達作為血管生成的指標。SKOV-3細胞經饑餓處理后用CoCl2化學缺氧，發現SKOV-3細胞經CoCl2處理后HIF-1α、VEGF-A和NF90表達均升高，而NF110無明顯變化（圖3）。

圖3 缺氧條件下NF90、HIF-1α和VEGF-A表達情況Fig.3 The protein expression of NF90， HIF-1α， and VEGF-A after cultured with CoCl2.

（三）Western blot驗證敲減NF90后HIF-1α和VEGF-A蛋白表達降低

將SKOV-3細胞經NF90/shRNA-control(Control)、NF90/shRNA(shNF90)轉染后，經CoCl2缺氧刺激模擬細胞缺氧環境，提取蛋白，WB驗證HIF-1α、VEGF-A、NF110、NF90蛋白表達情況，以β-tubulin蛋白作為內參。

CoCl2刺激后，SKOV-3細胞中HIF-1α、VEGF-A和NF90蛋白表達升高；Control組中HIF-1α、VEGF-A和NF90蛋白與未轉染經CoCl2刺激組無明顯差異；與Control組相比，shNF90組HIF-1α、VEGF-A和NF90蛋白表達明顯降低。各組中NF110蛋白表達無明顯變化（圖4）。

圖4 干擾/過表達NF90后HIF-1α和VEGF-A表達情況Fig.4 The protein expression of HIF-1α and VEGF-A after knockdown/overexpression of NF90.

（四）ELISA檢測缺氧環境下SKOV-3細胞上清液中VEGF-A濃度

VEGF-A為分泌性蛋白，收集慢病毒轉染、缺氧誘導下SKOV-3細胞的上清液，使用VEGF-A ELISA試劑盒測定各組上清液中VEGF-A的濃度，進一步驗證NF90與VEGF-A表達的相關性。

CoCl2誘導缺氧環境下，SKOV-3細胞上清液中VEGF-A濃度是無缺氧下SKOV-3細胞上清液的2.334倍（1104.193±18.537pg/ml vs 471.331±37.697pg/ml，p＜0.05）。與Control組細胞上清液相比，shNF90組細胞上清液中VEGF-A濃度降低了約57.6%（510.978±25.191pg/ml vs 1204.095±89.267pg/ml，p＜0.05）。

圖5 干擾NF90引起SKOV-3細胞上清液中VEGF-A濃度下降Fig.5 Knockdown of NF90 decreases of the secretion of VEGF-A in CoCl2， *p ＜0.05， compared with SKOV-3 without CoCl2， #p＜0.05， compared with Control group.

三、討論

NF90和NF110具有不同的C-端和細胞內定位，NF110全部位于細胞核內，作用受到極大限制[11]；而NF90一部分可與RNA相互作用定位于細胞核，另一部分通過與核糖核胞質接觸位于細胞質，參與調控DNA代謝[12]、轉錄[13][14]、翻譯[15][16]、mRNA穩定[7][17]以及多種病毒復制和基因表達[18][19][20]。NF90在多種惡性腫瘤的作用被廣泛研究：在宮頸癌中通過p53/p21信號通路抑制宮頸癌細胞凋亡，促進腫瘤增殖[21]，通過PI3K/Akt/HIF-1α/VEGF-A信號通路促進血管生成[8]；在肝細胞癌中通過與cyclin E1 mRNA結合加速細胞周期促進細胞增殖[7]；在乳腺癌中通過維持尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase-type plasminogen activator，uPA）表達促進侵襲和轉移[22]，通過增強VEGF mRNA穩定性，促進血管生成[23]。然而，另有研究發現在NF90過表達抑制裸鼠卵巢癌模型細胞增殖，NF90/NF110通過控制嵌入在DICER前體mRNA中的miR-3173的加工促進DICER表達，而miR-3173的過表達以NF90和DICER依賴性方式顯著增加轉移，提出通過促進DICER表達，NF90可以作為卵巢癌的抑制因子[24]。

本研究應用Oncomine和Human Protein Atlas數據庫發現NF90在卵巢癌，尤其是卵巢漿液性癌和內膜樣腺癌中表達顯著升高。體檢實驗構建卵巢癌細胞SKOV-3缺氧模型，進一步探討NF90對卵巢癌血管生成的影響，結果顯示，缺氧誘導NF90、HIF-1α和VEGF-A表達顯著升高；干擾NF90后，SKOV-3細胞HIF-1α和VEGF-A蛋白表達顯著降低，細胞上清液中VEGF-A濃度下降。

綜上，NF90在卵巢癌組織中高表達，并通過誘導VEGF-A表達促進卵巢癌血管生成，但其作用機制仍需進一步研究，為以后多靶點抗血管生成治療卵巢癌提供實驗思路。