內質網應激在深靜脈血栓小鼠中的作用

唐茂舜 朱車甫 陳東祥 鄭 義 李建平

1.中國科學院大學深圳醫院 （光明）神經外科，廣東深圳 518106；2.中國科學院大學深圳醫院 （光明）介入手術室，廣東深圳 518106；3.中國科學院大學深圳醫院 （光明）醫學實驗中心，廣東深圳 518106；4.中國科學院大學深圳醫院 （光明）心血管內科，廣東深圳 518106

深靜脈血栓（deep venous thrombosis，DVT）是一種繼心腦血管疾病之后最為常見的外周血管疾病，多發生在下肢，可繼發于手術、創傷、惡性腫瘤、既往的深靜脈血栓史等[1-2]。目前DVT的診斷主要還是通過患者的臨床癥狀并借助輔助檢查實現的，治療上主要是采用抗凝藥物、溶栓及手術取栓等綜合手段，但這些措施并不能完全消除血栓形成后的一些癥狀[3-4]。年齡、肥胖、吸煙、靜脈曲張等是DVT形成的危險因素，這些危險因素互相作用，致使血流滯緩，血管內皮缺氧缺血受損，血液凝度高，進而促使DVT發生[5-6]。而且目前研究認為靜脈內皮細胞結構和功能的紊亂是DVT形成的始動因素[7]，特別是氧化應激引起的內質網應激反應是血管內皮損傷的重要原因[8]。因此探討內質網應激在DVT形成過程中的作用對于DVT的發病機制及治療將具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

32只清潔級C57BL/6小鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 實驗試劑與儀器

蘇木素染液、伊紅染色液均購于武漢博士德生物科技有限公司，批號：AR11800-1、AR11800-2；Scott藍化液購于Solarbio公司，批號：G1865；Trizon Reagent購于北京康為世紀生物科技有限公司，批號：CW0580S；TUNEL檢測試劑盒購于碧云天生物技術有限公司，批號：C1088；放射免疫沉淀法（RIPA）細胞裂解液購于北京普利萊基因技術有限公司，批號C1053；兔抗糖調節蛋白78（GRP78）、X盒結合蛋白1（XBP1）、CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）多克隆抗體購于Affinity公司，批號：DF6025、AF5110、AF5366，稀釋度均為1/1000；兔抗天冬氨酸水解蛋白酶3（cleaved caspase 3）多克隆抗體購于美國Abcam公司，批號：ab2302，稀釋度1/1000；辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）購于北京中杉金橋生物科技有限公司，批號：ZB-2301。D1008E微型離心機購于SCJLOGEX；UV-1600PC紫外可見分光光度計購于上海美譜達儀器有限公司；TGL-16G低溫高速離心機購于常州中捷實驗儀器制造有限公司；Chemi DocTM XRS+超高靈敏度化學發光成像系統購于伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；DYY-6C蛋白垂直電泳儀購于北京市六一儀器廠。

1.3 實驗分組及造模

將32只小鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組，正常組10只，假手術組及模型組各11只，其中各1只用于模型驗證。模型組：小鼠按0.08 ml/10 g腹腔注射麻醉劑（5%水合氯醛），小鼠麻醉起效后，腹部剃毛，小鼠仰臥位放置在手術操作臺上，消毒腹部，逐層開腹，將腸內容物擠出位于操作者左側放置于生理鹽水潤濕的紗布上，暴露并分離下腔靜脈，將分離出的下腔靜脈與動脈同造模針頭（直徑0.3 mm，注射器針頭）一起用4-0醫用真絲編織縫合線結扎，迅速抽出針頭，并將下腔靜脈的可見分支進行結扎，關腹。假手術組：小鼠按0.08 ml/10 g腹腔注射麻醉劑（5%水合氯醛），小鼠麻醉起效后，腹部剃毛，小鼠仰臥位放置在手術操作臺上，消毒腹部，逐層開腹，將腸內容物擠出位于操作者左側放置于生理鹽水潤濕的紗布上，暴露并分離下腔靜脈，關腹。正常組：小鼠不做任何處理。

1.4 取樣

造模后24 h取各組小鼠下腔靜脈組織，正常組和假手術組將左腎靜脈至髂總靜脈分叉處之間的下腔靜脈段剪下，模型組小鼠取成血栓及其相應的下腔靜脈組織，每組取3個樣本置于10%福爾馬林溶液中固定用于HE染色，Tunnel染色檢測，每組取4樣本置于-80℃中保存用于western blot檢測。

1.5 HE染色

石蠟標本經流水沖洗數小時后，經梯度乙醇溶液脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟至透明。蒸餾水洗滌后，蘇木精染色液進行染色，流水洗去染色液，1%鹽酸乙醇進行分化，稍水洗，促藍液返藍，流水沖洗，伊紅染色，蒸餾水稍洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，細胞核染藍色，細胞漿染紅色。

1.6 TUNEL染色

石蠟切片置于65℃烤箱烘烤2 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，梯度乙醇脫水。按TUNEL檢測試劑盒說明書操作：切片置于濕盒中，加入Proteinase K工作液，37℃反應30 min。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌干凈，吸水紙吸干PBS，滴加TUNEL檢測液，45℃避光孵育2 h，PBS洗滌，封片顯微鏡下觀察，綠色熒光為凋亡細胞，藍色熒光為細胞核。

1.7 western blot檢測細胞中蛋白表達

收集細胞，加入細胞裂解液于4℃搖床上作用細胞30 min，后用移液槍反復的吹打細胞20次左右，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液。配置濃縮膠及分離膠，2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉（BCA）試劑盒檢測蛋白濃度并定量，30 μg蛋白樣品上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳直至目的蛋白分離，轉聚偏氟乙烯膜30 min。5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，一抗溶液4℃過夜孵育，次日室溫孵育二抗，將化學發光試劑加于膜上，于凝膠成像系統中曝光，并分析目的蛋白條（GRP78、XBP1、CHOP 及cleaved caspase 3）帶灰度值。

1.8 統計學方法

應用SPSS 20.0統計學軟件進行統計分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用SNK法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠HE染色結果

正常組及假手術組小鼠下腔靜脈無血栓形成，血管內膜表面光滑、平整。模型組下腔靜脈有混合血栓，主要為均勻分布的紅細胞，紅細胞之間有纖維素網狀結構，并有白細胞、血小板散在；血管內皮細胞不連續，靜脈周圍有大量炎癥細胞聚集。見圖1。

圖1 各組小鼠靜脈組織HE染色結果（×200）

2.2 各組小鼠TUNEL實驗結果

與正常組（2.35±0.13）%及假手術組（2.76±0.11）%比較，模型組小鼠靜脈內皮細胞凋亡率（32.58±0.43）%上升，差異有統計學意義（F=12 776.949，P=0.000）。見圖2。

圖2 各組小鼠靜脈組織TUNEL染色結果（×200）

2.3 各組小鼠靜脈組織中GRP78、XBP1、CHOP及cleaved caspase 3表達測定結果

與正常組及假手術組比較，模型組小鼠靜脈組織中GRP78、XBP1、CHOP及cleaved caspase 3蛋白表達量上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3、表1。

圖3 各組小鼠靜脈組織中GRP78、XBP1、CHOP及cleaved caspase 3表達測定結果

表1 各組小鼠靜脈組織中GRP78、XBP1、CHOP及cleaved caspase 3表達測定結果（±s）

表1 各組小鼠靜脈組織中GRP78、XBP1、CHOP及cleaved caspase 3表達測定結果（±s）

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3 討論

本研究通過小鼠下腔靜脈狹窄法構建小鼠DVT模型，造模24 h后，發現模型組小鼠腹腔內腸系膜靜脈明顯擴張，管壁顏色變暗，結扎處下方血管明顯腫脹，管壁顏色變暗，血管內有血凝塊，HE染色發現模型組小鼠管內充滿血栓，血管內皮細胞不連續，靜脈周圍有大量炎癥細胞聚集，這些研究結果與文獻報道基本一致[9]，也符合人體DVT急性期的病理表現[10]，說明本研究的造模成功。接著通過TUNEL實驗發現模型組小鼠下腔靜脈TUNEL陽性率高于正常組及假手術組，說明內皮細胞的凋亡在小鼠DVT的形成過程中發揮重要作用，但具體是由何機制所誘導的，本研究將進一步探討。

內質網（endoplasmic reticulum，ER）是真核細胞中重要的細胞器，對膜蛋白、分泌蛋白的折疊與加工，鈣的儲存與釋放具有重要調節作用，因此對細胞正常功能的維持至關重要。所以當內質網中蛋白的折疊、加工過程受阻，鈣離子穩態被打破后會使細胞發生致死性的損害。缺血缺氧、鈣超載、氧化應激等外界刺激均會使內質網功能發生障礙，進而觸發內質ERS[11-13]。適度的ERS有助于未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的清除，并促進鈣穩態的恢復，而過度的ERS導致未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白聚集、鈣穩態平衡被打破，內質網超負荷，并引起細胞凋亡。ERS主要通過激酶R樣內質網激酶（PERK）、需肌醇酶1（IRE1）、活化轉錄因子6（ATF6）等3條信號通路發揮作用。在正常生理條件下，糖調節蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）通過與PERK、IRE1、ATF6結合形成復合物，阻斷這些信號通路的傳遞。但在應激條件下，GRP78從復合物中解離出來，與未折疊或錯誤折疊蛋白結合，使得這些蛋白無法從ER中輸出，同時這些信號通路被激活。其中激活的IRE1活化X盒結合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1），活化的XBP1激活CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）凋亡途徑，最終將信號傳遞給Caspase家族，誘導細胞凋亡。而且非晶態二氧化硅納米顆粒（SiNPs）處理的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs），線粒體腫脹，內皮細胞凋亡，ER染色加強，GRP78、XBP1、CHOP、Capase-12表達量均上調，繼而提示內質網應激誘導的凋亡途徑可能是SiNPs誘導內皮細胞凋亡的機制之一[14]。所以說GRP78從跨膜蛋白上解離是ERS啟動的第一步，因此GRP78在細胞內的高表達提示ERS的開始[15]。本研究通過western blot實驗發現模型組較正常組及假手術組靜脈組織中GRP78蛋白表達量上調，預示著ERS的開始促進了DVT的形成。另外本研究western blot實驗結果還發現模型組中XBP1、CHOP蛋白表達量均上調，western blot實驗結果表明DVT小鼠靜脈組織中cleaved caspase 3蛋白表達量較正常組及假手術組上調，說明GRP78、XBP1、CHOP、cleaved caspase 3介導的內質網應激反應所誘導的小鼠內皮細胞凋亡是小鼠DVT形成的重要原因。

綜上所述，本研究發現內質網應激介導的內皮細胞凋亡是小鼠DVT形成的重要原因，且此過程是通過GRP78、XBP1、CHOP、cleaved caspase 3信號進行傳導的，但具體是如何進一步的調控有待于本課題組下一步研究。