葡萄AKR基因家族的鑒定和組織特異性表達分析

馬亞男 盧旭 魏云春 李康 魏若男 李勝 馬紹英

（1. 甘肅農業大學生命科學技術學院，蘭州 730070；2. 甘肅農業大學園藝學院，蘭州 730070；3. 甘肅農業大學基礎實驗教學中心， 蘭州 730070）

在植物的生長發育過程中，不可避免地會遇到生物或非生物脅迫的影響，例如，土壤鹽堿含量過高、極端溫度、干旱和病蟲害等［1-2］。研究表明，非生物脅迫下植物體內活性乙醛和活性氧（ROS）的水平會提高并導致植物受到損傷。為抵御不良環境植物會產生大量氧化還原酶，將ROS、活性乙醛等有毒物質分解為毒性較小的乙醇與碳水化合物，其中醛酮還原酶（AKR）家族發揮著重要作用［3］。

AKR是氧化還原酶中的組成部分，屬于單體胞質蛋白，并以NADP（H）為輔酶氧化還原羧基底物，在生物體中起著核心作用［4-5］。目前關于AKR催化機制的研究的已有較多報道［6-7］。AKR家族成員均以NADPH作為輔酶，由具有相似的三維結構和還原羰基基團的蛋白酶組成［8-9］。AKR催化反應時，輔酶NADPH首先結合到AKR上，接著底物再結合至AKR上。催化反應結束后，產物首先釋放，然后氧化態輔酶再釋放出來。其催化底物主要有脂肪族和芳香族，而芳香族又分為單糖、酮基、醛基、類固醇等［4-5］。AKR在結構上約有320個氨基酸殘基，約35 kD的長度，在進化中具有高度保守性。ARK保守結構域是經典的（α/β）8桶狀折疊結構，特異性主要由（α /β）8桶狀結構羧基端的3個環（LooP A、LooP B、LooP C）的不同組成和大小決定［10］。AKR催化活性位點是由 N 末端催化四聯體（Asp50、Tyr55、Lys84）所構成［10］。該催化四聯體被認為是AKR負責底物催化的關鍵氨基酸［11］。另有研究發現，C末端形成的高度保守的氨基酸殘基（Ser271、Arg276）在輔基結合過程中起重要作用［10］。在正常條件下，AKR在植物生長過程中通過參與調控細胞的生長和分化發揮重要的功能［12］。當植物遭遇逆境脅迫時，AKR一方面會催化醛、酮、類固醇以及其他羰基化合物的還原活性緩解外界脅迫的壓力［3］，另一方面會通過調控次級代謝物合成、維持細胞滲透壓來抵御逆境脅迫［13］。

在植物中，已有研究人員從擬南芥［14］，番茄［15］，甘藍［16］，白菜［17］及棉花［18］等物種克隆得到AKR基因，并發現AKR 基因參與植物細胞生長發育過程中許多氧化還原反應，可增強植物對于逆境脅迫的抵抗能力，也可促進植物的生長發育及代謝過程［19］。éva等［14］發現將克隆的擬南芥AKR4C9 在缺乏AKR的野生型大麥中表達可提高植株對鹽脅迫的耐受性。Kanayama等［20］報道，氧化脅迫、寒冷和鹽脅迫下薔薇科桃樹（Prunus persica）中克隆到的 PpAKR1 的 mRNA豐度提高，將PpAKR1轉入擬南芥提高了植株NADP-依賴型多元醇脫氫酶的活性以及對鹽的耐受性。然而在葡萄中對該基因的研究還鮮有報道。因此，本研究利用生物信息學方法，分析鑒定葡萄全基因組序列中的AKR家族基因，從基因組水平分析AKR基因在葡萄染色體分布，基因結構，motif序列，順式作用原件和進化關系等，利用相關數據庫分析了AKR家族成員在葡萄不同組織的表達情況，并分析鹽脅迫下葡萄AKR家族基因表達水平隨時間變化規律，旨在為進一步研究AKR基因提高葡萄耐鹽功能機制提供參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

選取甘肅農業大學生命科學技術學院植物組織培養實驗室保存的葡萄試管苗作為供試材料，葡萄品種為品麗珠（Cabernet Franc）。選取長勢一致的單莖葉接種于含50 mL GS液體培養基的錐形瓶中培養，培養基pH為5.8-6.0，溫度設置為26℃/20℃（光照/黑暗），光周期設置為16 h/8 h（光照/黑暗）。培養25 d后，挑選長勢一致的葡萄試管苗進行后續實驗。后續將原培養基緩慢倒出，重新倒入50 mL含50 mmol/L NaCl的GS液體培養基繼續培養。分別處理3 h、6 h、9 h、12 h和24 h后采集葉片用于后續RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 葡萄AKR家族基因成員鑒定及理化性質分析 首先從已知文獻中得到22個擬南芥AKR基因ID，接著從擬南芥基因組數據庫TAIR（https://www.arabidopsis.org/）下載擬南芥AKR基因編碼的氨基酸序列。將獲得的氨基酸序列輸入到葡萄基因數 據 庫 中（https://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/），查找葡萄AKR基因組成員信息。將所得基因進行DNAMAN比對，去掉冗余序列和片段小于100 bp的序列，共搜索得到13個葡萄AKR基因，分別下載基因全長、CDS序列和氨基酸序列。利用ExPASy數據庫（https://web.expasy.org/protparam/）中的ProtParam在線分析工具對蛋白質的理論等電點、氨基酸大小、分子量、不穩定指數、親水性等基本信息進行分析［21］。

1.2.2 葡萄AKR基因家族進化關系、基因結構、motif序列分析 利用 ClustalX 對擬南芥、苜蓿和葡萄的氨基酸序列進行多重比對［22］；使用 MEGA7.0 軟件構建AKR基因家族系統發育樹，對構建的系統進化樹進行自檢，bootstrap設定為1 000，處理缺失數據選用Complete deletion，選用P-distance模型對葡萄 AKR基因進行分類［23］。運用GSDS（https://gsds. cbi.pku.edu.cn/）進行基因結構分析［24］；利用MEME網站（https://meme-suite.org/tools/meme）進行motif分析［25］。

1.2.3 葡萄AKR家族順式作用元件及基因芯片表達譜分析 使用PlantCARE軟件（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對啟動子順式作用元件進行預測分析［26］。使用BAR數據庫（https://bar.utoronto.ca/#）檢索葡萄不同生長階段的卷須、葉片、芽、軸、皮膚、花、種子、花粉、果肉、果皮、根等組織器官中AKR基因的表達水平，再對數據進行log2轉換，最后使用Omic-share網站（https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/getsoft）制作熱圖。

1.2.4 葡萄AKR基因家族二級結構及亞細胞定位分析 使用WoLF PSORT網站（http//www.genscript.com/wolf-psort.html）在線進行亞細胞定位。蛋白質二級結構則通過SOPMA在線分析網站（https://www.predictprotein.org/signin#）進行預測。

1.2.5 鹽脅迫下葡萄AKR基因家族的實時定量分析 RNA提取采用植物提取試劑盒AG21019（湖南艾科瑞生物工程有限公司，長沙）并按照說明書進行操作。cDNA合成采用TIANGEN公司FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒，過程參照說明書。引物設計及后期引物合成均由上海生工生物工程技術服務有限公司完成（表1）。熒光定量總體系為20 μL：上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL及SYBR Green 10 μL。反應程序設定為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，循環次數為40。

表1 葡萄AKR基因家族實時熒光定量引物Table 1 Real-time fluorescence quantitative primers of AKR gene family in grape

1.2.6 試驗數據統計與分析 選擇葡萄UBI基因對數據進行歸一化處理，基因相對表達量使用2-ΔΔCt法計算。使用SPSS 20計算組間差異的顯著水平，Excel軟件計算組內誤差。使用Omic-share（https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/getsoft）網站繪制熱圖。

2 結果

2.1 葡萄AKR家族基因理化性質分析

由表2分析可知，經blast比對得到13條葡萄AKR家族基因，分別命名為VvAKR01- VvAKR13。其分布于葡萄19條染色體中的3條：Chrom01分布的基因最多，依次是VvAKR02- VvAKR08；其次是Chrom08，VvAKR09-VvAKR13均分布于此染色體；Chrom18分布1個基因VvAKR01。成員編碼氨基酸數在275-430之間，VvAKR06氨基酸序列最長，含430個氨基酸殘基，VvAKR11最短，只含有275個氨基酸殘基；不穩定指數介于27.01-51.55，VvAKR07基因編碼的氨基酸不穩定性最低，為27.01，VvAKR05編碼的氨基酸不穩定性最高，為51.55；脂肪指數介于83.57-96.88之間，且該基因家族均具有疏水性；成員分子量在32 083.49-48 655.51之間；理論等電點（pI）分布在5.83-9.01之間。

表2 葡萄AKR基因理化性質Table 2 Physical and chemical property of AKR genes in grape

2.2 葡萄AKR家族基因同源性比對及其進化分析

對擬南芥、苜蓿和葡萄AKR家族基因（AtAKR、MtAKR和VvAKR）采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統發育樹，通過構建聚類樹將其分為3個亞族（I、II、III），由圖1可知，其中I亞族包含的葡萄AKR家族成員最多，有7個，分別為VvAKR01、03、04、05、06、07和08；II亞族包含6個家族成員，分別為VvAKR02、09、10、11、12和13；III亞族沒有發現VvAKR基因。

圖1 擬南芥、苜蓿和葡萄AKR基因的進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of AKR genes in Arabidopsis，alfalfa and grape

2.3 葡萄AKR家族基因結構分析

對13個葡萄AKR基因進行結構分析。由圖2可知，外顯子數在4-13之間，VvAKR01外顯子數最少，僅有4個，VvAKR09和VvAKR13外顯子數最多，分別有13個；VvAKR02基因最長，可達23 kb左右，VvAKR05基因最短，僅1.5 kb左右；VvAKR01，10，11和12基因均含有外顯子，內含子及上下游結構，而VvAKR03和VvAKR04僅具有外顯子和內含子，無上游結構和下游結構。

圖2 葡萄AKR家族基因結構Fig.2 Structures of AKR gene family in grape

2.4 葡萄AKR家族基因motif序列分析

在葡萄AKR家族基因中共找到了6個motif。由圖3可知，13個VvAKR家族成員中，最長氨基酸保守序列有50個氨基酸殘基，最短序列有12個，所有成員均含有氨基酸的保守域結構。保守motif分析表明，除VvAKR08外，其他基因均含有motif 1-6；分析發現，VvAKR基因家族成員的C端由motif 3組成；N端由motif 4組成。

圖3 葡萄AKR家族motifs（1-6）分析Fig.3 Motif analysis of AKR gene family in grape

2.5 葡萄AKR基因家族的順式作用元件分析

啟動子順式作用原件預測結果表明，葡萄AKR家族基因啟動子區域鑒定到20個特異響應順式作用元件，結果如圖4所示。該轉錄因子都存在核心元件TATA-box和增強元件CAAT-box，具備真核生物基因啟動子的基本結構特征。除基本的順式作用元件外，AKR基因還存在其它元件：激素響應元件（TATC-box，CGTCA-motif，TGACG-motif，TGAelement，AuxRR-core，TCA-element和ABRE），脅迫響應元件（MBS，LTR，TC-rich），器官特異性元件（CAT-box）和光調控元件（ACE，G-box，TCTmotif，MRE，I-box，GATA-motif）。激素響應元件具體有茉莉酸甲酯（CGTCA-motif，TGACG-motif），赤霉素（TATC-box），水楊酸（TCA-element），脫落酸（ABRE）和生長素應答順式元件（AuxRR-core，TGA-element）。

圖4 葡萄AKR基因家族的順式作用元件分析Fig.4 Cis-acting element analysis of AKR gene family in grape

2.6 葡萄AKR家族基因芯片表達譜分析

使用mRNA水平的表達數據制作熱圖。葡萄AKR家族基因芯片表達模式分析表明，13 個VvAKR基因的表達量在不同植物組織和發育時期有較大的差異（圖5）。在幾乎所有葡萄組織中，例如卷須，莖、芽、根、花、葉、種子、幼苗等器官，VvAKR02，VvAKR11和VvAKR12都表現出相對較高的表達水平，VvAKR09僅在種子中高表達，VvAKR10、VvAKR13則僅在花粉中高表達。此外，VvAKR03、VvAKR04、VvAKR05、VvAKR06在葡萄組織中表達量均相對較低。

圖5 葡萄AKR家族基因表達譜Fig.5 Expression profile of AKR genes in grape

2.7 葡萄AKR家族蛋白質二級結構和亞細胞定位預測

二級結構分析結果如表3所示，葡萄AKR家族基因編碼的13個蛋白的二級結構均含有α-螺旋（34.42%-48.91%），β-轉角（3.80%-8.39%），擴展鏈結構（7.38%-18.06%）和不規則卷曲（33.42%-44.19%）。亞細胞定位分析表明，葡萄AKR家族基因主要在細胞核中表達。除VvAKR05外葡萄AKR家族基因在細胞核中均有表達；在葉綠體中表達的 有VvAKR01、02、03、04、05、06、09、10和13；在細胞骨架中表達的有VvAKR01、02、04、06、07、08、09、11和12；在細胞膜中表達的有VvAKR03、06、08、09和12；在線粒體中表達的只有VvAKR03、05和06；在內質網中表達的僅有VvAKR05和VvAKR11；在液泡中表達的只有VvAKR11和VvAKR12。

2.8 鹽脅迫下葡萄AKR家族基因表達特征分析

為探究鹽脅迫下葡萄AKR家族基因表達水平隨時間變化的規律，以未用鹽處理的葡萄葉片為對照，采集鹽處理3 h，6 h，9 h，12 h和24 h五個不同時長的葡萄葉片進行qRT-PCR試驗。結果表明（圖 6），隨著鹽脅迫時間延長，VvAKR02，03，05，06，07，10，11，12和13表達水平在不同時間點存在不同程度的提升，但變化趨勢不盡相同。其中相對表達量變化趨勢表現為先升高后降低最后回升的基因為VvAKR02，05，07，11，12和13，在3 h或6 h表達量上調，隨后降低，再于12 h和24 h逐步回升，且這6個基因在鹽脅迫后各個時間點的表達水平都較對照表達上調。而VvAKR03，06和10雖然在某一個時間點較對照上調表達，但鹽脅迫后總體表達水平下調。VvAKR01，04，08和09鹽脅迫處理后不同時間點表達水平顯著降低。

圖6 葡萄AKR家族基因響應鹽脅迫表達模式分析Fig.6 Expression pattern analysis of grape AKR family genes in response to salt stress

3 討論

本文以擬南芥已知AKR基因序列為基礎，同源比對出13個葡萄AKR家族基因成員。將葡萄與擬南芥、苜蓿的AKR家族基因共同構建進化樹后，可將所有基因根據進化關系分為3個亞族（I、II、III）。I亞族包含的葡萄AKR家族成員最多，III亞族中沒有葡萄AKR基因分布，II亞族中包含VvAKR02，VvAKR09，VvAKR10，VvAKR11，VvAKR12和VvAKR13六個成員，其中VvAKR02，VvAKR11，VvAKR12和VvAKR13親緣關系相近且在響應鹽脅迫時的熒光定量結果中都呈現上調表達的情況且分支中成員與植物響應鹽脅迫相關，推測該進化樹對VvAKR功能分類有一定參考作用。同一亞族氨基酸序列上外顯子的分布位置差異性較大，且序列長度無明顯規律。葡萄AKR家族基因中共找到了6個motif，除VvAKR08外，其他基因均含有motif 1-6，表明葡萄AKR家族基因間保守程度高。在蛋白質編碼水平上外顯子數量、長度及分布位置無規律，在蛋白水平上成員間保守程度高，AKR家族不同成員采取不同的轉錄翻譯過程最終形成具有相近功能的成熟蛋白質，說明此家族基因上的保守程度與蛋白上的保守程度并不一致。亞細胞定位和二級結構分析表明，葡萄AKR家族基因成員多在細胞核中表達，因此推測該家族成員對葡萄細胞核內的信號轉導具有重要功能，此研究結果與甘藍及苜蓿AKR家族的聚類分析結果相似［16，27］。

生物信息學分析表明，AKR家族成員均具有疏水性，不穩定指數均較低。不同基因編碼的氨基酸數各不相同，平均含有325個氨基酸，平均蛋白質量為36 kD，這與先前發表的大多數AKRs含有約320個氨基酸，蛋白大小為33-37 kD的觀點一致［28］，說明鑒定結果可靠。基因芯片分析表明，13個VvAKR基因的表達量在不同植物組織和發育時期各不相同，這種在轉錄表達上的差異可以歸因于啟動子中順式元件的種類和數量。VvAKR02，VvAKR11和VvAKR12幾乎在所有葡萄組織中均表現出相對較高的表達水平，包括卷須、莖、芽、根、花、葉、種子、幼苗等，推測這幾個基因對葡萄的生長發育起著主要調控作用［18］。VvAKR09在種子中高表達，而VvAKR10，VvAKR13僅在花粉中高表達，說明不同的AKR家族成員具有組織特異性，此研究結果與苜蓿AKR基因家族的研究結果相似［27］。

順勢作用元件結果表明，VvAKR順式作用元件中大量存在生長素，脫落酸，低溫和干旱等響應元件，表明其在植物生長和對環境脅迫的響應中具有潛在的功能。由前人對AKR家族進行全基因組分析和功能分析可知，當植物受到干旱［29-30］、高溫和低溫［2，29］、高鹽［29］、紫外線［30］、過氧化氫［31］、百草枯［31］。病原菌毒素［32-33］等生物和非生物脅迫時，植物體內的AKR被誘導表達，進而參與一系列的代謝過程。本文在分析鹽脅迫處理后葡萄AKR基因表達模式后可知，各基因在脅迫后不同時間點的表達存在明顯差異。VvAKR02、VvAKR05、VvAKR07、VvAKR11、VvAKR12和VvAKR13表 達 顯 著 上 調，VvAKR03、VvAKR06和VvAKR10存在不同程度的上調，VvAKR01、VvAKR04、VvAKR08和VvAKR09的表達量表現為下調。這說明葡萄AKR家族基因參與葡萄鹽脅迫響應，且不同基因對鹽脅迫的響應模式不同，其中VvAKR02、VvAKR05、VvAKR07、VvAKR11、VvAKR12和VvAKR13可能與葡萄耐鹽相關。此研究結果與洋地黃中克隆得到的AKR基因表達情況 相似［29］。

4 結論

本文從葡萄中鑒定得到13個AKR家族基因，該家族基因在葡萄不同發育時期和不同組織器官表達存在差異；上游存在豐富的順式作用元件，除核心元件和增強元件之外，同時還存在各種激素及脅迫響應元件，器官特異性元件和光調控元件；在鹽脅迫下，該家族中VvAKR02，VvAKR05，VvAKR07，VvAKR11，VvAKR12和VvAKR13可受鹽脅迫誘導表達上調。通過對葡萄AKR基因結構，進化關系，功能的研究分析，有助于了解葡萄AKR基因家族成員的結構與功能的關系，并且為揭示AKR基因響應鹽脅迫的調控機制和信號轉導網絡的研究和挖掘葡萄耐鹽基因奠定一定的理論基礎。