不同連作年限菠蘿園土壤差異代謝物和細菌群落結構 分析

劉傳和 賀涵 何秀古 劉開 邵雪花 賴多 匡石滋 肖維強

（1. 廣東省農業科學院果樹研究所/ 農業農村部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/ 廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室， 廣州 510640；2. 廣東省農業科學院，廣州 510640）

連作障礙制約著果樹產業的可持續發展，化感自毒作用是引起果樹連作障礙的主要原因之一［1］。有機酸、直鏈醇、酚酸、萜類和生物堿等代謝物多數屬于自毒物質［2］，其中萜類和酚酸類物質是導致土壤化感自毒作用的關鍵代謝物［3］。作物長期連作后根際分泌的苯甲酸、羥基苯甲酸和肉桂酸等酚酸類代謝物通過與土壤根際微生物互作而不斷積累，阻礙土壤有機質的分解和礦化，妨礙了根系對土壤養分的吸收［4-7］，導致自毒作用加劇。

土壤細菌群落作為土壤生態環境的重要組成部分［8］，其群落結構的變化與連作密切相關。在大豆、煙草、茶樹、香榧等作物連作后土壤研究表明，連作后以糖類、氨基酸類碳源利用為主的細菌數量顯著減少，根際土壤細菌碳源利用率下降［9］。連作導致土壤中細菌種類減少、細菌多樣性降低，土壤細菌群落多樣性和豐富度指數下降，土壤微生物類型逐漸由“細菌型”向“真菌型”轉變，土壤微生物出現失衡［8，10-14］。在門水平上分析表明連作后土壤的優勢菌門厚壁菌門（Firmicutes），以及有益菌門變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）等所占比例逐漸下降［12，15］。土壤細菌根瘤菌目和酸微菌目的相對豐度，以及分枝桿菌屬（Mycobacterium）、藤黃單胞菌屬（Luteimonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、浮霉菌屬（Planctomyces）細菌的多樣性因連作而減少［13-14］。

菠蘿（Ananas comosus（L.）Merr.）又稱鳳梨，是著名的熱帶水果。據統計，我國現有菠蘿種植約97.1萬畝，產量約173.3萬t［16］。我國菠蘿消費量約以年均7.5%速度在增長，市場需求量大，菠蘿產業為我國熱區經濟社會發展做出了重要貢獻。菠蘿連作在我國各產區十分普遍。果農在菠蘿果實收獲后，將莖葉粉碎還田翻松土壤后再種植菠蘿［17-18］，并施用大量化肥，循環往復，常連續種植10余年甚至更長。隨著連作年限的增加，菠蘿果實產量、品質明顯降低，產業發展受到影響。有關菠蘿連作對土壤代謝物及細菌群落結構的影響變化等仍不清楚。

本研究基于非靶向代謝組學及16S rDNA高通量測序技術，以菠蘿園邊角地未耕作過的土壤為對照，對連續種植5 a和15 a菠蘿的土壤代謝物和土壤細菌群落結構進行比較分析，篩選出不同連作年限菠蘿園土壤中的差異代謝物及代謝通路，分析細菌群落組成及豐度變化。本研究旨在探討菠蘿園土壤代謝物及細菌群落結構的變化與菠蘿連作年限的關系，為菠蘿連作相關研究奠定基礎，也為菠蘿的田間管理、土壤環境保護等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究取樣區域選擇在我國最大的菠蘿主產區廣東省湛江市徐聞縣。本次采集的土壤樣品來自徐聞縣菠蘿的主要種植區曲界鎮，土壤類型為磚紅壤。

選擇連續種植了菠蘿5 a、15 a的菠蘿園土壤（分別簡寫成T5、T15）及菠蘿園邊角地未耕作過的土壤（T0，對照）作為研究對象。菠蘿種植園每造均用吸芽苗種植，種植品種為“巴厘”，畝植4 000棵，果實收獲后菠蘿莖葉粉碎還田。每造菠蘿畝施尿素100 kg、復合肥（N15-P2O515-K2O15）150 kg，分別于種植后的第4個月（尿素50 kg、復合肥50 kg）和第8個月（尿素50 kg、復合肥100 kg）分兩次施完。

本研究土壤取樣于2020年3月中旬進行。每個種植年限選擇3個園區（園區間隔 100 m 以上）。所有種植菠蘿的園區坡向、坡度和管理措施基本一致。取樣時菠蘿種植園當造菠蘿未施首次大肥，每個園區隨機選擇東部、西部2個位置作為取樣對象。每個位置隨機選取兩個取樣點（相距5 m）。取樣時先除去地表5 cm厚的表層土壤，采用內徑為5 cm土鉆采集0-20 cm土層樣品，每個取樣點平行鉆取2鉆；兩個取樣點的土樣混為1個樣品，共18個樣品，每處理6次重復。取樣后用離心管裝好立即置于液氮中速凍2 h后在-70℃超低溫冰箱中暫存。

1.2 方法

1.2.1 土壤代謝物的測定

1.2.1.1 土壤代謝物的提取 （1）取樣本1 000 mg于5 mL EP管中，加入1 000 μL提取液（甲醇∶水=3∶1，V/V），再加入1 000 μL乙酸乙酯及5 μL 核糖醇，渦旋30 s；（2）加入鋼珠，35 Hz研磨儀研磨4 min，超聲5 min（冰水浴）；（3）將樣本于4℃離心，10 000 r/min離心15 min；（4）移取上清液于5 mL EP管中，再加入1 000 μL提取液（甲醇∶水=3∶1，V/V）和1 000 μL乙酸乙酯，重復以上2、3步驟，合并所有上清液；（5）在真空濃縮器中干燥提取物；（6）向干燥后的代謝物中加入20 μL甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg/mL），輕輕混勻后，放入80℃烘箱中孵育30 min；（7）向每個樣品中加入30 μL BSTFA（含有1% TMCS，V/V），將混合物在70℃孵育1.5 h；（8）冷卻至室溫，向混合的樣本中加入5 μL FAMEs（溶于氯仿）；（9）上機檢測。

1.2.1.2 代謝物GC-TOF-MS檢測 Agilent 7890氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀配有Agilent DB-5MS毛細 管 柱（30 m×250 μm×0.25 μm，J&W Scientific，Folsom，CA，USA），GC-TOF-MS具體分析條件如表1。

1.2.1.3 代謝物測定數據處理與分析 使用ChromaTOF軟件（V4.3x，LECO）對質譜數據進行處理［19］，使用LECO-Fiehn Rtx5數據庫，將質控（Quality Control）樣本中檢出率50%以下或RSD＞30%的峰去除［20］后的有效數據用于后續實驗分析。

采用R（3.3.2）包ropls進行正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal projections to latent structures- discriminant analysis，OPLS-DA）模型計算，獲取更可靠的代謝物的組間差異信息；采取將差異倍數（fold change）、t檢驗的P值（P value＜0.05）和OPLS-DA模型的VIP值（variable importance in the projection，VIP＞1）——變量投影重要度相結合的方法篩選差異代謝物；采用單因素方差（ANOVA）分析繪制的火山圖（volcano plot）統計差異代謝物在T0-T5和T0-T15比較組中的表達水平；采用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）對差異代謝物進行通路富集分析。

1.2.2 微生物16S rDNA測序分析 微生物16S rDNA的擴增及測序委托北京百邁客生物科技有限公司完成。PCR擴增引物為：（16SF）AGRGTTTGATYNTGGCTCAG，（16S-R）TASGGHTACCTTGTTASGACTT；PCR擴 增 程 序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環；72℃延伸7 min，4℃保存。

采 用PacBio測 序 平 臺，對CCS（Circular Consensus Sequencing）序列進行Barcode識別和長度過濾，得到Optimization-CCS，使用Usearch軟件［21］對Tags在97%的相似度水平下進行聚類并劃分OTU，根據OTU的序列組成得到其物種分類，基于OTU分析結果，對樣品在各個分類水平上進行分類學分析，獲得各樣品在門、屬分類學水平上的物種分布圖與在目水平上的物種聚類熱圖。稀釋性曲線（dilution curve）用于檢驗測序數據量［22］；ACE、Chao1、Shannon及Simpson指數用于分析細菌菌群的多樣性及豐度；非度量多維標定法（Non-MetricMulti-Dimensional Scaling，NMDS）［23］分析細菌菌群結構差異；斯皮爾曼（Spearman）相關性分析物種在環境樣本中的共存關系。通過典范對應分析（canonical correspondence analysis，CCA）［24］在屬水平細菌菌群和pH等理化指標之間的相關性，樣品射線與pH射線成銳角即為正相關，成鈍角為負相關。

2 結果

2.1 不同連作年限菠蘿園土壤樣本OPLS-DA法判別分析

圖1顯示，不同連作年限菠蘿園土壤微生物代謝物模型參數中R2X=0.776，R2Y=0.979，Q2Y=0.888，說明不同連作年限菠蘿園土壤代謝模型對自變量X的解釋程度為77.6%；對分類變量Y的解釋程度為97.9%，對樣本變量的預測程度為88.8%，該模型R2Y非常接近1，表明OPLS-DA模型為有效模型，樣本數據真實可靠度較高、穩定性和預測能力較強。

圖1 不同連作年限菠蘿土壤所有樣本OPLS-DA得分圖Fig.1 OPLS-DA scores of all soil samples from the pineapple orchard in different continuous-cropping years

OPLS-DA模型能直觀的展示出組間的分離情況，18個樣本均處于95%置信區間內，T5、T15組間接近且有部分重疊但與對照明顯分開，表明T5和T15組間代謝模式接近，但均與對照存在顯著差異。組內各樣本聚集，分散程度較小。

2.2 不同連作年限菠蘿園土壤差異代謝物火山圖分析

圖2分別顯示了T5組、T15組與對照組（T0）間的差異代謝產物分布情況。由火山圖可知，T5組與T0組土壤間有120個差異代謝物，其中顯著增加（P＜0.05）的有119個，顯著降低（P＜0.05）的有1個；T15組與T0組土壤微生物中有80個差異代謝物，其中顯著增加（P＜0.05）的有60個，顯著降低（P＜0.05）的有20個。

圖2 差異代謝物火山圖Fig.2 Volcano plot of differential metabolites

2.3 顯著差異代謝物篩選

運用OPLS-DA模型的分析方法，將差異倍數（FC＞2）、t檢驗P值（P value ＜0.05）和VIP值（VIP ＞1）相結合的標椎對T0-T5比較組和T0-T15比較組差異代謝物進行篩選，共篩選出11個具有顯著性差異（P ＜0.05）的代謝物（表2）。其中，有機酸4種，氨基酸及其衍生物2種，糖類3種，醇類2種。

據表2可知，T0-T5比較組和T0-T15比較組差異代謝物的組分含量存在差異。與T0相比，T5中的有機酸類代謝物（2R，3S）-2-羥基-3-異丙基丁二酸、4-羥基苯甲酸、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸的表達分別升高了1.924倍、1.538倍、1.569倍和1.740倍；而在T15中，與T0相比這4種代謝物的表達分別提高了2.099倍、2.191倍、1.879倍和1.746倍。類似地，T5中N-乙酰基-β-丙氨酸、N-氨基甲酰谷氨酸的表達分別較T0升高了2.211倍和2.327倍；而在T15中N-乙酰基-β-丙氨酸、N-氨基甲酰谷氨酸的表達分別較T0升高了3.186倍和3.440倍。

表2 不同比較組間差異代謝物Table 2 Differential metabolites among the comparison groups

與T0比較，T5中的糖類、醇類代謝物表達提高的倍數高于T15中糖類、醇類代謝物含量提高的倍數。T5中的葡萄糖、槐糖、松三糖的含量水平分別比T0升高了4.878倍、4.201 倍和1.292倍；而在T15中葡萄糖的含量水平比T0提高了1.580倍，槐糖、松三糖的含量則分別降低了3.892倍和1.386倍。類似地，與T0相比，T5中的醇類代謝物（3β，5α，6β）-膽固醇3，5，6-三醇、山梨糖醇含量提高了3.071倍和2.244倍；而T15中這2種代謝物的含量水平分別提高了1.568倍和1.901倍。

2.4 差異代謝物KEGG富集分析

2.4.1 基于HMDB數據庫的差異代謝物統計 如圖3所示，T0-T5比較組在HMDB數據庫檢索到的差異代謝物種類有8種，T0-T15比較組檢索到的差異代謝物種類有6種。在T0-T5比較組和T0-T15比較組中同時檢索到的差異代謝物有5種，分別為脂肪酰基、苯及其取代衍生物、有機氧化合物、類固醇和類固醇衍生物、肉桂酸及其衍生物。其中，苯及其取代衍生物、肉桂酸及其衍生物、類固醇和類固醇衍生物在T0-T5比較組和T0-T15比較組所占比例相同。在T0-T5組檢索到的有機氧化合物類代謝物有3個，在T0-T15組有2個；T0-T5組檢索到的脂肪酰基類代謝物有8個，在T0-T15組有3個。此外，僅在T0-T5組中檢索到的差異代謝物有3種，分別為吡啶及其衍生物、非金屬氧陰離子化合物和羧酸及其衍生物；僅在T0-T15組中檢索到的差異代謝物有1種，為二嗪類代謝物。

圖3 T0-T5比較組和T0-T15比較組差異代謝物HMDB分類圖Fig.3 HMDB classification map of differential metabolites from the comparison groups of T0-T5 and T0- T15

2.4.2 差異代謝物代謝通路分析 KEGG通路富集分析表明，顯著差異代謝物主要富集在11條代謝通路上（表3），分別為果糖和甘露糖代謝、類固醇生物合成、苯丙烷生物合成、泛醌和其他萜類醌的生物合成、酪氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、亞油酸代謝、葉酸生物合成、異喹啉生物堿的生物合成和不飽和脂肪酸的生物合成。

表3結果顯示，這11條通路所對應的代謝物有8個。3，4-二羥基苯甲酸主要參與苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成。4-羥基苯甲酸和4-羥基肉桂酸共同參與苯丙氨酸代謝和泛醌及其他萜類醌的生物合成途徑；并且，4-羥基苯甲酸還參與葉酸生物合成途徑；而4-羥基肉桂酸參與苯丙烷和異喹啉生物堿的生物合成途徑，此外，4-羥基肉桂酸還可單獨參與酪氨酸的代謝過程。山梨糖醇主要參與果糖和甘露糖代謝過程，膽固醇主要參與類固醇生物合成途徑；亞油酸既可單獨參與亞油酸代謝途徑，又可與山崳酸和木質酸一起共同參與不飽和脂肪酸的生物合成途徑。

表3 差異代謝物代謝通路分析Table 3 Metabolic pathway analysis of the differential metabolites

2.4.3 KEGG富集網絡圖 KEGG富集網絡圖（圖4）更直觀顯示了T5、T15差異代謝物所參與的關鍵代謝通路，且每條關鍵通路多為一種以上的代謝物所共同參與的，同一條通路的代謝物組成有明顯差異。由圖4可知，不飽和脂肪酸的生物合成途徑在T5、T15代謝中的影響均最大，但參與不飽和脂肪酸的生物合成的代謝物有差異，在T5中受到油酸、山崳酸、花生酸、亞油酸和木質酸共同的影響，而在T15中主要受到亞油酸、木質酸和山崳酸的影響；其次，苯丙氨酸代謝途徑在T5中的影響較大，泛醌及其他萜類醌的生物合成途徑在T15中的影響較大，而這兩種代謝途徑均是由4-羥基苯甲酸和4-羥基肉桂酸所共同參與的。此外，圖4-A顯示T5對氧化磷酸化途徑的代謝影響較大；圖4-B顯示T15對β-丙氨酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的生物合成和亞油酸代謝的影響較大。以上結果表明，T5、T15代謝水平存在一定的差異，顯著差異代謝物在T5、T15同一條代謝通路中的影響也有所不同。

圖4 差異代謝物KEGG富集網絡圖Fig. 4 KEGG pathway enrichment map of differential metabolites

2.5 不同連作年限菠蘿園土壤細菌16S測序數據

對T0及T5、T15土壤進行16S全長測序（6次重復），分析了細菌群落的多樣性。通過Barcode識別后共獲得122 534條CCS序列，每個樣品至少產生3 889條CCS序列，平均產生6 807條CCS序列，過濾后共獲得121 795條（99.47%）有效CCS序列用于后續實驗分析，樣品平均序列長度為1 447 bp，在97%的相似水平下進行聚類分析，共獲得OUT 9582個。由圖5可知，當測序量接近5 000讀長時，稀釋性曲線（dilution curve）逐漸趨于平緩，表明本試驗樣品序列充足，取樣能夠真實地反映菠蘿地土壤中的細菌群落結構多樣性。

圖5 不同連作年限菠蘿園土壤樣品的稀釋性曲線Fig. 5 Dilution curve of soil samples in the different continuous-cropping years of the pineapple orchard

如圖6，細菌在OTU水平上的NMDS分析結果顯示，T5、T15土壤細菌群落分布比T0更集中，且T5、T15之間細菌群落明顯分開，說明不同種植年限菠蘿地土壤細菌群落結構存在顯著差異。

圖6 不同連作年限菠蘿園土壤細菌群落NMDS分析Fig. 6 NMDS analysis of different soil bacterial community in the different continuous-cropping years of the pineapple orchard

2.6 不同連作年限菠蘿園土壤細菌群落多樣性和相對豐度變化

在門水平上對細菌群落相對豐度進行分析，如圖7-A所示，從土壤中鑒定到的細菌主要來自6個門，約占細菌總數的67.72%，分屬放線菌門（Actinobacteriota）、變形細菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、浮霉菌門（Planctomycetota）、厚壁菌門（Firmicutes）。其中放線菌門（Actinobacteriota）、變形細菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、浮霉菌門（Planctomycetota）為菠蘿地土壤的優勢菌群，這些菌在T5、T15土壤中分別占細菌總數的70.51%和89.82%。圖7-A顯示，T5、T15土壤中厚壁菌門（Firmicutes）所占比例較T0明顯減少，放線菌門（Actinobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）和浮霉菌門（Planctomycetota）所占比例顯著增加。變形細菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteriota）在T5土壤中所占比例最高，但在T15土壤中比例降低，低于T0。

圖7-B表明，從屬水平上分析T5、T15土壤細菌群落的相對豐度明顯高于T0。與T0相比，T5土壤在屬水平上相對豐度顯著增加的細菌群落主要有伍氏束縛菌（Conexibacter）、Thermosporothrix、Aciditerrimonas、Acidibacter、Fimbriiglobus、Actinoallomurus；T15土壤顯著增加的屬有分枝桿菌屬（Mycobacterium）、中華單胞菌屬（Sinomonas）、Conexibacter、Thermosporothrix、Aciditerrimonas、Fimbriiglobus、Actinoallomurus。但T5、T15土壤伯克氏菌屬（Burkholderia）的相對豐度較T0明顯降低。

圖7-C所示為在目水平上T0與T5、T15土壤細菌群落相對豐度的差異。與T0相比，T5土壤中顯著增加的細菌目有Azospirillales、黃色單胞菌目（Xanthomonadales）、Polyangiales、Pedosphaerales、Isosphaerales、Solibacterales、酸桿菌目（Acidobacteriales）、芽單胞菌目（Gemmatimonadales）、Gammaproteobacteria-Incertae-Sedis、細鏈孢菌目（Catenulisporales）；顯著減少的細菌目有鏈霉菌目（Streptomycetales）、假諾卡式菌目（Pseudonocardiales）。而T15土壤相對豐度顯著增加的細菌目有乳桿菌目（Lactobacillales）、弗 蘭 克 氏 菌 目（Frankiales）、土壤紅桿菌目（Solirubrobacterales）、黏 球 菌 目（Micrococcales）、酸 微 菌 目（Acidimicrobiales）、Streptosporangiales、芽孢桿菌目（Bacillales）、棒桿菌亞目（Corynebacteriales）、Gaiellales；顯著減少的細菌目有根瘤菌目（Rhizobiales）、鏈霉菌目（Streptomycetales）、假諾卡式菌目（Pseudonocardiales）。T5、T15相對豐度均顯著減少的細菌目有鏈霉菌目（Streptomycetales）和假諾卡式菌目（Pseudonocardiales）。

圖7 不同連作年限菠蘿園土壤細菌群落在門、屬、目水平上的相對豐度Fig. 7 Relative abundance of different soil bacterial community at phyla，genus and order level in the different continuouscropping years of the pineapple orchard

2.7 不同連作年限菠蘿園土壤細菌群落多樣性 分析

表4所示，T5土壤的ACE和Chao1指數均顯著高于T15和T0；而T15土壤的ACE和Chao1指數均低于T5和T0。結果表明T5土壤細菌相對豐度升高，T15細菌群落相對豐度下降。如表4所示，T5、T15的Simpson指數分別為0.01和0.04，顯著低于T0（0.12）；而T5、T15的Shannon指數分別為5.39、4.66，顯著高于T0（3.90）。結果表明T5、T15土壤中細菌群落多樣性增加，且以T5土壤中細菌群落多樣性相對更高。

表4 不同連作年限菠蘿園土壤細菌豐度與多樣性Table 4 Diversity of relative abundance of different bacterial of soil under different continuous-cropping years of the pineapple orachard

2.8 不同連作年限菠蘿地土壤細菌群落與土壤pH的相關性

由圖8可知，連作年限與土壤pH成負相關；細菌屬（Aciditerrimonas）、Acidibacter、Actinoallomu- rus、Paraburkholderia與pH成正相關，分枝桿菌屬 （Mycobacterium）、Gaiella、中 華 單 胞 菌 屬（Sino- mo-nas）、Conexibacter、Thermosporothrix與pH成 負 相關。

圖8 不同連作年限菠蘿園土壤中細菌群落與pH值的相關性CCA分析Fig. 8 CCA analysis correlating bacterial community to pH value of soil under different continuous-cropping years of the pineapple orchard

3 討論

糖類作為微生物的主要碳源，為微生物正常代謝提供所需要的能量。已有研究表明，大豆連作導致葡萄糖的組分含量下降，同時，隨連作時間的延長，土壤多糖含量逐漸降低，影響土壤有機質的組成及植株的生長發育［25-26］。這與本研究中，連續種植了15年菠蘿的土壤中槐糖、松三糖的表達水平降低的結果相似。

酚酸類代謝物是多數作物的主要化感物質，其自毒潛力隨種植年限的增加而有上升的趨勢［3，27］。本研究表明，菠蘿連作后土壤中的4種有機酸類代謝物的表達水平均升高，尤其是在菠蘿連作15年的土壤中酸類代謝物的表達升高幅度更大。由于長期連作，施肥量大，有機酸類物質增加，造成土壤逐漸酸化，不僅容易滋生出大量好酸性微生物，也加劇了土壤的自毒作用［27-32］。菠蘿連作5年、15年后土壤中4-羥基苯甲酸等酚酸類物質的含量水平均提高，且連作15年提高的幅度更大，表明菠蘿長期連作對土壤環境產生了不利影響。在蠶豆、花生等的連作障礙研究中發現，肉桂酸、苯甲酸和對羥基苯甲酸等自毒物質是導致連作障礙的重要影響因 子［3，30］。茄子連作障礙的研究也表明，連作后土壤中的肉桂酸濃度增加，加劇了茄子的自毒作用［33］。連作后土壤中的對羥基苯甲酸含量增加影響了土壤微生物活性與多樣性，導致土壤中的細菌、放線菌數量減少，真菌數量增加［34］，土壤中有益生物減少、有害生物增加，最終導致連作障礙的發生［35］。

KEGG代謝通路分析表明，不同連作年限菠蘿地土壤差異代謝物主要富集在不飽和脂肪酸的生物合成途徑等11條代謝通路中，并且每條關鍵通路多為一種以上的代謝物所共同參與的。不飽和脂肪酸的生物合成途徑對連作5年、15年菠蘿土壤代謝的影響均最大，該途徑是由亞油酸、山崳酸和木質酸等有機酸共同參與的代謝途徑，這可能與連作導致土壤酸化，有機酸參與的代謝活動增強有關［36-37］。

土壤細菌代謝旺盛、繁殖快，種類多、數量大，是土壤微生態環境質量的重要組成部分，對作物的生長有著重要的影響。研究發現，細菌群落的變化與連作障礙關系密切［12，38］。本研究通過微生物16S測序對細菌群落結構分析結果表明，與對照相比，連續種植菠蘿5年和15年的土壤細菌群落多樣性提高，但連續種植菠蘿15年的土壤細菌群落的相對豐度降低，這與其他作物連作相關研究結果相 似［12，39］。土壤pH值在細菌群落結構形成中起著重要作用，是決定細菌群落結構演替與群落結構發生分異的主要驅動因子，土壤pH與土壤細菌群落的相關性最高［38，40-41］。基于CCA分析結果表明，土壤pH與菠蘿連作年限呈負相關，這不僅為菠蘿長期連作后導致土壤酸化做出了解釋，也為菠蘿連作后導致土壤細菌群落減少，土壤pH變化在調節細菌群落發生分異中的作用提供了有利的證明。長期種植單一作物導致土壤微生物多樣性出現不同程度的下降，根際微生態環境受到破壞［14］，需要采取減施化肥、輪作、休耕等措施控制土壤的酸化與鹽分積累，提高微生物群落尤其是細菌群落的多樣性，提高土壤生態系統的穩定性［42-43］。

4 結論

菠蘿連作后土壤中的酸類代謝物表達水平升高。連續種植5年菠蘿的土壤中葡萄糖、槐糖、松三糖等糖類代謝物的表達水平升高。連續種植了15年菠蘿的土壤中槐糖、松三糖的表達水平降低；葡萄糖的表達水平雖高于菠蘿園邊角地未耕作過的土壤，但低于連續種植5年菠蘿的土壤中葡萄糖的表達水平。細菌16S測序表明，連續種植菠蘿5 年和15 年的土壤細菌群落結構存在明顯差異；連作5年、15年土壤細菌群落多樣性提高，但連作15年的土壤細菌群落相對豐度降低。