脂多糖對鯉腸上皮細胞轉錄組模式的調控分析

陳建軍 趙怡迪 曹香林

（1. 河南師范大學生命科學學院，新鄉 453007；2. 河南師范大學水產學院，新鄉 453007）

鯉是中國最重要的淡水魚之一，營養豐富，肉質鮮美［1］。在水質惡化、飼料變質等情況下，以鯉為代表的吃食性魚類易引發細菌性腸道疾病，從而阻礙了水產養殖業的可持續發展［2-3］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜結構的重要組成成分，因其是革蘭氏陰性細菌的主要毒力因子，常用于致病機制的研究［4］。腸上皮細胞（intestinal epithelial cells，IEC）是腸道內外環境的媒介，又是機體免疫屏障的重要組成部分［5］。在開展環境細菌對魚類腸道毒理學機理研究中，采用活體暴露方式，往往由于實驗動物的個體差異，造成誤差和不確切的結果［6］。因此，采用鯉腸上皮細胞培養方法，利用離體細胞開展機理研究更為 理想［7］。

轉錄組測序（RNA-seq）技術作為一種高效、快捷的轉錄組研究方法［8］，能夠反映細胞在某一特定環境和時間的基因表達情況，通過差異基因的表達分析和功能富集分析，挖掘功能基因［9］。呂鈞惠等通過RNA-seq技術分析研究中國青鳉原代肝細胞中雌激素響應基因，并篩選出了105個顯著差異基因（37個上調，68個下調）［10］。岳影星等［11］采用RNA-seq技術對脂多糖處理大鼠心臟微血管內皮細胞進行了轉錄組學分析，GO和KEGG富集的結果表明，上調基因與內皮細胞對炎性免疫細胞的趨化作用和黏附作用密切相關；而下調基因則是與鈣離子信號和G蛋白相關通路以及內皮通透性增加有關。

本研究以鯉腸上皮細胞為實驗對象，經脂多糖暴露24 h后，利用RNA-seq技術獲得轉錄本后，通過差異基因的表達分析和功能富集分析，揭示脂多糖調控鯉腸上皮細胞差異基因的功能和通路。并利用實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）方法，驗證轉錄組差異表達基因結果的可靠性。此研究有助于全面深入了解細菌對鯉腸道疾病發生發展的分子機制，為開展環境細菌的魚類毒理學研究提供了重要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

鯉腸上皮細胞系IECs購自中國科學院上海細胞庫；LPS L7770購自美國Sigma公司；MEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；0.25%含EDTA胰酶消化液和PBS緩沖液購自美國HyClone公司；青鏈霉素混合液、二甲基亞砜購自北京索萊寶公司；RNAiso Plus、cDNA 反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；UltraSYBR Mixture購自北京康為世紀公司。

CO2細胞培養箱（美國Thermo公司，型號：HERAcell 240 i）；蒸汽滅菌鍋（TOMY公司，型號：KG-SX-500）；超微量分光光度計（Thermo公司，型號：NANODROP 2000）；超凈工作臺（北京亞太克隆儀器技術有限公司，型號：BCL-定制型）；超速低溫離心機（德國SiGMA公司，型號：3K30）；熒光定量PCR儀（羅氏生物科技公司，型號：LightCycler?96）。

1.2 方法

1.2.1 細胞傳代與培養 鯉腸上皮細胞使用MEM培養基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液的完全培養基培養，待細胞生長至對數期時進行1∶2傳代培養。取生長狀態良好的鯉腸上皮細胞進行細胞計數，調整細胞數以5×106個/孔接種于6孔板中，待細胞貼壁后，對照組加入PBS緩沖液；脂多糖組加入LPS溶液使其終濃度為100 μg/mL（LPS溶液由PBS緩沖液配制）；每組設置3個生物學重復，于28℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h采樣。

1.2.2 RNA提取與文庫構建 使用RNAiso Plus試劑對不同處理組的細胞進行總RNA提取，使用超微量分光光度計和安捷倫2100生物分析儀對總RNA的濃度、質量和完整性進行檢測；檢測合格的RNA樣品構建測序文庫，在上海歐易高通量測序平臺Illumina Hiseq進行測序，獲得Clean Reads數據。

1.2.3 基因注釋與數據分析 利用hisat2將樣本數據（Clean Reads）與鯉的參考基因組進行序列比對，用基因組注釋文件對所獲得的序列進行基因注釋［12］。利用FPKM法計算基因表達量，設定參數（|log2fold change|＞1且q-value＜0.05）篩 選 差異表達基因［13-14］。采用Gene Ontology（GO）數據庫和KEGG數據庫對差異表達基因分別進行GO和Pathway富集分析［15-16］。

1.2.4 qRT-PCR驗證差異基因 隨機選取10個DEG，利用Oligo 7.0設計引物進行qRT-PCR以驗證轉錄組數據的準確性（引物列表見表1）。具體的方法首先用RNAiso Plus提取細胞總RNA，將RNA按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，以獲得cDNA為模板、β-actin為內參基因，采用LightCycler?96熒光定量PCR儀器進行qRT-PCR擴增，反應程序：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火60 s，45個循環；溶解曲線條件為：95℃ 15 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s；冷卻：37℃ 30 s。每個樣品設置 3 次重復，采用2-△△CT計算各實驗組差異基因的表達量及變化倍數（FoldChange），并對FoldChange值進行log2轉化。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers for qRT-PCR

1.2.5 統計學方法 使用SPSS16.0 軟件通過單因素方差分析（one-way ANOVA）分析對照組和脂多糖組之間的差異。與對照相比，P＜0.05被認為具有統計學顯著性差異。

2 結果

2.1 轉錄組測序數據質量分析

轉錄組分析共計6個樣本，包括對照組樣本：CON_1、CON_2、CON_3；和脂多糖組樣本：LPS_1、LPS_2、LPS_3。對照組和脂多糖組樣品得到原始測序序列（Raw reads）均高于50.14M條，進一步對含有接頭及低質量的Reads過濾得到Clean reads用于后續分析，共得到44.77G的Clean Data，GC含量46.50%-46.91%，Q30大于93.88%，其中，近81.83%的序列能夠比對到參考基因組（表2）。此結果說明本次測序數據質量良好，可用于后續進一步生物信息學分析。

表2 轉錄組數據質量分析Table 2 Quality analysis of transcriptome data

2.2 轉錄組差異表達分析

按照DEG篩選標準（P＜0.05且Fold Change＞2），綜合CON和LPS樣本基因表達分析共篩選出590個DEGs，上調和下調分別有303個和287個（圖1）。通過繪制火山圖可以了解差異表達基因的整體分布情況，灰色為非顯著性差異的基因，紅色為顯著性上調差異基因，綠色為顯著性下調差異基因。

圖1 差異表達基因統計柱狀圖及火山圖Fig. 1 Statistical histogram of differentially expressed genes and volcano map

2.3 GO富集分析

GO分析表明，共有1 752個基因得到歸類注釋，涉及生物學過程（biological processes）、細胞組分（cellular components）及分子功能（molecular function）3大類，共59個亞類（圖2）。在生物過程中共涉及23個亞類，DEG顯著富集于細胞過程（cellular process）類別、其次為單有機體過程類別（single-organism process）及代謝過程類別（metabolic process）。在細胞組成中共涉及16個亞類，DEG顯著富集于細胞（cell）、其次為細胞部分類別（cell part）及細胞器類別（organelle）。在分子功能共涉及20個亞類，結合功能類別（binding）DEG富集最多，其次催化活性功能類別（catalytic activity）及傳感器活性功能類別（transducer activity）。上述GO功能富集分析表明，脂多糖參與調控鯉腸上皮細胞的生物學過程、細胞組分及分子功能。

圖2 差異表達基因GO分類Fig. 2 GO classification of differentially expressed genes

2.4 KEGG途徑分析

KEGG途徑分析表明，DEG被注釋到106條通路途徑中，其中KEGG富集的前20個途徑，如圖3氣泡圖所示。氣泡越大的條目包含的差異蛋白編碼基因數目越多，其富集P value值越小，顯著程度越大。通過 KEGG分析表明，差異表達基因顯著富集到細胞周期（cell cycle path：ccar04110）、自噬（autophagy path：ccar04140）、 凋 亡（apoptosis path：ccar04210）、mTOR信號通路（mTOR signaling pathway path：ccar04150）、P53信號通路（p53 signaling pathway path：ccar04115）、DNA復制（DNA replication path：ccar03030）、嘧啶代謝（pyrimidine metabolism path：ccar00240）、錯配修復（mismatch repair path：ccar03430）、堿基切除修復（base excision repair path：ccar03410）、核苷酸切除修復（nucleotide excision repair path：ccar03420）等10個信號通路。我們發現脂多糖主要誘導鯉腸上皮細胞周期、自噬、凋亡通路途徑。

圖3 差異基因顯著富集的前20條KEGG信號通路Fig. 3 Top 20 KEGG signaling pathways with significant enrichment of different genes

2.5 自噬、凋亡、細胞周期的差異表達基因分析

KEGG代謝途徑中與自噬、凋亡、細胞周期途徑相關的差異表達基因，如表3所示。其中上調差異表達基因主要顯著富集到自噬、凋亡；下調差異表達基因主要顯著富集到細胞周期。轉錄組中注釋到自噬途徑中的LC3、BNIP3、ULK1、TP53INP2、LAMP、ATG16基因被誘導上調；轉錄組中注釋到凋亡途徑中的Casp9、Cathepsin、Gadd45、AP-1等基因被誘導上調表達，Lamin及PARP基因被誘導下調。此外，Gadd45基因在細胞周期途徑中也被誘導上調；轉錄組中注釋到細胞周期途徑中PCNA、Cdc14、CycB、CDK2、MCM2、PLK1、TGF-β基因在脂多糖刺激過后顯著下調。結果顯示了LPS阻滯了鯉腸上皮細胞周期，誘導自噬，引起細胞凋亡。

表3 自噬、凋亡、細胞周期的差異表達基因Table 3 Differentially expressed genes of autophagy，apoptosis and cell cycle

2.6 qRT-PCR 驗證基因表達

為驗證轉錄組數據是否準確、可信，隨機選取10個差異基因進行qRT-PCR檢測。結果表明qRTPCR測定結果與RNA-seq測序結果得到的差異基因表達變化趨勢一致（圖4），表明本研究中基于RNA-seq測序得到的數據是可信的。

圖4 qRT-PCR驗證RNA-seq測序的結果Fig. 4 qRT-PCR validates RNA-seq sequencing results

3 討論

腸道是魚類重要的免疫消化器官，腸上皮細胞作為體內更新較快的一類細胞，在食物的消化、營養物質的吸收、保護機體免受微生物感染等方面發揮重要作用［17-18］。脂多糖作為細菌細胞壁的主要成分，是革蘭陰性菌的主要毒力因子，可誘導細胞功能和結構損傷［19］。本研究通過轉錄組測序技術，全面、快速地獲取脂多糖暴露于鯉腸上皮細胞過程中的所有轉錄本信息，系統地分析相關基因表達變化，為脂多糖調控的鯉腸上皮細胞分子機制提供理論依據。轉錄組測序共獲得44.77 G高質量數據，其中，近81.83%的數據能夠比對到鯉基因組。利用DESeq軟件分析，與對照組相比，LPS處理可誘導差異表達基因590個，其中303個表達上調，287個表達下調。通過GO注釋分析發現，鯉腸上皮細胞經LPS處理后，在細胞過程、單一生物過程、代謝過程、細胞、細胞組分、細胞器、結合和催化活性功能中發生了改變。KEGG 注釋分析發現，DEG顯著富集于細胞周期、自噬、凋亡等通路。注釋豐富的轉錄組數據將為進一步分析脂多糖調控的鯉腸上皮細胞周期、自噬、凋亡通路基因提供重要的理論基礎。

本研究發現脂多糖阻滯了鯉腸上皮細胞細胞周期進程，而細胞周期調控網絡的異常與疾病的發生發展密切相關［20］。近年來的大量研究表明，Gadd45在DNA損傷時細胞周期檢查點的調控、DNA修復和細胞凋亡中起了重要作用，維持著細胞基因組的的穩定性［21］。Gadd45對G2/M期檢查點的調控主要是通過抑制Cyclin B/ CDK2復合物活性而實現 的［22-23］。DNA損傷誘導產生的Gadd45被轉運入核后，解離Cyclin B/CDK2復合物，改變Cyclin B的亞細胞分布，使Cyclin B從核中輸出，進入細胞質被泛素介導降解［24］。這樣抑制了CDK2激酶的活性，并使細胞阻滯在G2/M轉變中［25］。細胞周期的每個階段都是被嚴格調控的，檢查點的存在是為了檢測潛在的DNA損傷，并允許在細胞分裂前修復［26］。如果損傷不能修復，細胞則會凋亡［27］。本研究發現，脂多糖通過誘導DNA損傷，增加Gadd45的表達從而抑制Cyclin B1/ CDK2復合物活性，阻滯鯉腸上皮細胞周期進程。

與此同時，本研究還發現脂多糖可誘導鯉腸上皮細胞自噬，引起細胞凋亡。自噬，是一種溶酶體降解反應，在饑餓和壓力等惡劣條件下，可通過降解細胞蛋白、細胞器和細胞質，從而維持細胞的新陳代謝［28］。許多研究表明，在外界壓力情況下，細胞通過BNIP3介導的自噬來對抗外界壓力，維持生存；自噬受多種信號通路的調控，如AMPK/mTOR等信號轉導通路，LC3在自噬信號通路中占有舉足輕重的地位［29-30］。其中LC3可在TP53INP2的幫助下，從細胞核移位至細胞質完成脂質化修飾，參與自噬體的生成［31］。我們的研究發現脂多糖可以通過激活mTOR信號通路，誘導BNIP3和TP53INP2的表達促進LC3的轉化來誘導自噬。另外，自噬在細胞存活，特別是細胞凋亡信號通路中起著重要作用［32］。細胞凋亡受到嚴格調控，在正常細胞中，Caspase處于非活化的酶原狀態，凋亡程序一旦開始，Caspase被激活后發生凋亡蛋白酶的級聯反應，從而導致細胞核（脫氧核糖核酸酶DNAse激活，PARP片段化），細胞骨架（lamin）和細胞代謝發生改變，發生不可逆的凋亡［33］。Lamin A/C和PARP是維持細胞正常功能和活力的基本核成分，有研究發現細胞毒性藥物誘發的凋亡與Lamin及PARP兩種核蛋白的降解呈正相關［34］。目前研究結果證明，脂多糖激活Caspase9，并且引起細胞凋亡和Lamin及PARP兩種核蛋白的降解。細胞凋亡被認為是一個突出的病理特征，慢性疾病常伴隨著許多細胞凋亡［35］。因此干預脂多糖誘導的鯉腸上皮細胞凋亡可能會延緩疾病進展并降低腸道疾病的發病率。

4 結論

本研究利用RNA-seq技術與生物信息學相結合，闡明了脂多糖阻滯鯉腸上皮細胞周期、通過誘導自噬引起細胞凋亡等一系列的毒性效應。本研究鑒定的DEG和信號傳導途徑將為研究和闡明養殖魚類中的細菌感染性腸道疾病提供重要的理論基礎。