懷菊不同部位內生細菌多樣性分析

田存章賀新平萬嘉欣姬國杰周紅偉崔靖吳文龍

(1.新鄉醫學院三全學院生物與基礎醫學實驗教學中心，河南 新鄉 453003；2.新鄉醫學院三全學院生命科學技術學院，河南 新鄉 453003)

菊花是菊科植物菊的干燥頭狀花序，懷菊花作為河南4大懷藥之一，其氣清香，味甘、苦，具有清熱解毒、清肝明目等功效[1]，具有極高的應用價值。現代藥理研究表明，菊花具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降血脂等藥理活性[2]。

植物內生菌指某些微生物在其生活史的一定階段或全部階段寄生于健康植物體內、又不引起宿主植物明顯病害癥狀的微生物，其與宿主存在著和諧共生關系[3]。內生菌普遍存在于植物的各種組織、器官及細胞間隙當中，具有豐富的生物多樣性，是植物微生態系統的重要組成部分。內生菌包括內生細菌、放線菌和真菌。近年來，植物內生細菌作為重要的微生物資源，其可能參與植物的生理活動和代謝，給植物帶來新的變化和功能，很多研究表明,藥用植物的內生細菌可以產生與宿主相同或相似的活性物質，其代謝產物具有抗菌、降血壓、保護心血管等多種藥理作用。張國榮等人研究報道,藥用植物川芎可分離出產生川芎嗪的5株枯草芽孢桿菌，其產物川芎嗪具有改善微循環、保護心血管、防止血栓形成等多種藥理作用[4]。李玲玲采用瓊脂塊法和雙層平板法對從藥用植物青蒿中分離的內生細菌的抑菌活性進行研究，發現19株內生細菌中有18株具有抑菌活性，抑菌活性菌株的比例最高，達到了95%[5]。鞠鑫等從人參中分離得到內生假單胞菌G13476，通過MTT、Western Blot實驗發現，菌株G13476次級代謝產物可下調Bcl-2、上調Bax，實現對乳腺癌的抑制作用[6]。

高通量測序技術是目前研究微生物的群落及種類信息的常用技術手段，具有信息量大、可靠性高、可重復性好等優點，李秋樺等應用高通量測序技術對7種不同品種的梨內生細菌多樣性進行研究分析，為進一步研究梨與內生細菌間的互作關系奠定了一定基礎[7]；劉蓬蓬等基于Illumina MiSeq高通量測序技術對黃芪內生細菌的16S rDNA的區域序列進行分析，從而確定了黃芪內生細菌的優勢菌群和菌群生物多樣性[8]。目前，關于植物內生細菌的研究報告很多，但有關藥用菊花懷菊內生細菌的研究報道相對較少，本研究以藥用懷菊為試驗材料，基于高通量測序技術對懷菊不同部位內生細菌分布及群落特征進行初步分析，以期為懷菊花內生細菌資源的合理開發應用提供依據。本研究為懷菊內生菌資源的進一步研究與開發應用提供了一定的理論數據。

1 材料與方法

1.1 材料

懷菊，于2020年11月采自河南省新鄉市武陟縣。

1.2 試劑與儀器

基因組提取試劑盒，OMEGA公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒，Thermo Fisher Scientific公司；Pico-21臺式離心機，Thermo Fisher公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；FR-1000凝膠成像系統，上海復日科技有限公司；Qubit?3.0熒光計，Invitrogen公司；ETC 811PCR儀，北京東勝創新生物科技有限公司。

1.3 樣品材料表面消毒

選擇生長良好懷菊，采樣后用水沖洗干凈，吸取水分后，將其部分莖、葉、花材料置于超凈工作臺中紫外燈照射20min，之后用10%的次氯酸鈉溶液浸泡處理5min，無菌水沖洗3～6次，用無菌濾紙吸取多余水分，備用。

1.4 消毒可靠性檢測

1.4.1 漂洗液培養

用最后一次沖洗消毒后試驗材料的無菌水涂布平板，37℃條件下培養24h后，觀察培養結果，以檢測表面消毒的可靠性。

1.4.2 組織印跡檢測

參考李玲玲等實驗方法[3]，用無菌鑷子夾住已消毒處理過的供試植物材料，使其消毒表面與相應固體培養基充分接觸3～5min后取出，于適當條件下培養24h，以檢測表面消毒的可靠性。

1.5 內生細菌的多樣性檢測

1.5.1 樣品總DNA的提取

分別取適量懷菊莖、葉、花樣品于2mL無菌離心管中，經破碎儀破碎后，參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒方法提取基因組DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，并使用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對DNA進行精確定量。

1.5.2 PCR擴增及其測序

以提取的總DNA為模板對細菌16S rDNA的V3-V4區域序列進行PCR擴增，PCR擴增參照張雙虹等兩輪PCR擴增方法[9]。高通量測序由生工生物工程股份有限公司基于Illumina MiseqTM/HiseqTM高通量測序平臺完成。

1.5.3 數據處理

將得到的測序序列，使用Cutadapt軟件去除引物接頭序列，使用PEAR軟件對測序序列進行拼接，根據樣本中標簽序列和引物序列從拼接數據中分割出各樣本數據，并使用PRINSEQ切除部分低質量值序列，過濾掉低復雜度的序列，最終得到有效測序數據。使用Usearch軟件對個樣本優化序列按照97%相似水平上進行OTU聚類；再對OTUs進行豐度、Alpha多樣性指數等進行分析，探索懷菊內生菌的種群分布特征及多樣性。測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 結果分析

2.1 懷菊材料消毒可靠性檢測

懷菊試驗材料消毒后最后一次漂洗液培養和組織印記培養，結果表明,培養基中均無微生物菌落長出，表明試驗材料消毒滅菌可靠。

2.2 懷菊不同部位內生細菌測序有效序列長度分布

懷菊莖、葉、花不同部位高通量測序得到的原始序列質控后得到V3-V4區域的有效序列數在63797～77327條，有效序列合計為215632條，長度在357～474bp，平均長度為407bp，菊花莖、葉、花測序質控后得到有效序列分別為77327、74508和63797條，見表1。

表1 有效序列數據統計

2.3 懷菊不同部位內生細菌OUT、多樣性分析

按照97%相似度對序列進行OTU聚類，一個OUT的序列被認為可能是來自于同一個種屬的序列，懷菊有效序列共聚成57個OTUs，排除未分類細菌類型后，分屬10個細菌門、17個細菌綱、23個細菌目、27個細菌科和25個細菌屬。由表2可知，菊花莖、葉、花分布聚成54、54和51個OTUs。所有樣品的OTU覆蓋度均大于99.9%，說明樣品的覆蓋度很廣，測序結果可反映樣品中內生細菌群落組成的真實情況。去除未分類細菌類型后，懷菊莖聚成的可分類OUT序列分屬10個細菌門、16個細菌綱、23個細菌目、27個細菌科和25個細菌屬，懷菊葉聚成的可分類OUT序列分屬10個細菌門、16個細菌綱、22個細菌目、26個細菌科和23個細菌屬，懷菊花聚成的可分類OUT序列分屬10個細菌門、16個細菌綱、22個細菌目、25個細菌科和22個細菌屬，說明懷菊不同部位的內生細菌在分類階元在數量上存在差異。

由表2可知，結合菊花不同部位內生細菌的多樣性指數中的Shannon、Simpson、Chao和Ace指數分別在0.30～0.62、0.67～0.88、51.75～54.75和52.02～55.17；說明懷菊不同部位內生細菌多樣性指數存在一定的差異。綜合分析4個多樣性指數，顯示菊花花中內生細菌多樣性較高，葉中多樣性最低，而莖中的群落豐富度較高，花中的群落豐富度最低。在屬水平上，菊花不同部位的內生細菌的優勢菌均為Streptophyta屬，其在菊花莖、葉、花中占比分別為87.21%、93.85%和79.93%，另外，分別有2個菌屬為懷菊莖、葉所特有，Capnocytophaga和Asticcacaulis菌屬為懷菊莖特有菌，2個未分類菌屬為懷菊葉所特有。研究結果表明，菊花不同部位內生細菌的菌群結構存在一定差異。

表2 內生細菌Alpha多樣性

3 結論

本試驗以懷菊為研究材料，利用高通量測序技術對懷菊不同部位內生細菌的組成及分布特征進行研究，發現懷菊不同部位的內生細菌在某些分類階元在數量上存在差異。通過對懷菊不同部位內生細菌的多樣性指數進行分析，表明菊花不同部位內生細菌多樣性指數存在一定的差異，顯示菊花花中內生細菌多樣性較高，莖次之，而葉最低。菊花不同部位的內生細菌的優勢菌均為Streptophyta屬，Capnocytophaga和Asticcacaulis菌屬為懷菊莖特有菌，2個未分類菌屬為懷菊葉所特有，說明菊花不同部位內生細菌的菌群結構存在一定差異。