油茶葉多糖的閃式提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

葉 潤(rùn)， 蔡 靜， 李盡哲， 孫 偉， 申家朋

(1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院,河南 信陽(yáng) 464000； 2.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 林學(xué)院, 河南 信陽(yáng) 464000)

油茶(CamelliaoleiferaAble.)，別名茶油樹(shù)、茶子樹(shù)等，屬茶科，常綠小喬木，主要分布于我國(guó)的云南、廣西、浙江、河南、安徽等地[1-2]。油茶是我國(guó)主要的油料作物之一，享有“東方橄欖油”的美譽(yù)，其果實(shí)榨出的油，脂肪酸含量低，多酚含量高，對(duì)人體有益處[3-4]。近年來(lái)有很多文獻(xiàn)對(duì)油茶籽及殼的化學(xué)成分及藥理活性進(jìn)行了報(bào)道，但是對(duì)油茶葉的研究文獻(xiàn)較少。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對(duì)油茶葉多糖的閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)得到的油茶葉多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)試，以期提高油茶的應(yīng)用價(jià)值，為油茶資源的合理開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)支持。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料、試劑及儀器

油茶葉，2020年3月份采于信陽(yáng)市光山縣槐店鄉(xiāng)油茶基地，樹(shù)齡8年，為普通油茶品種，經(jīng)信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院中藥制劑教研室梁麗香副教授鑒定，油茶葉經(jīng)干燥處理，粉碎至0.300 mm，備用；葡萄糖對(duì)照品，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、ABTS的二銨鹽、抗壞血酸(VC)，均為分析純，購(gòu)于上海晶抗生物工程有限公司；無(wú)水乙醇、雙氧水、苯酚、水楊酸、過(guò)硫酸鉀、硫酸亞鐵，均為分析純，購(gòu)于上海中石化三井化工有限公司。

FA2204B電子分析天平，上海精科天美公司；JHBE-60T閃式提取器，上海釩幟精密設(shè)備有限公司；RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市英峪予華儀器；UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1油茶葉多糖的閃式提取 參考文獻(xiàn)[5～6]操作，稱取20 g油茶葉粉末，置于閃式提取器中，按一定的料液比加入蒸餾水，在一定溫度下提取一定時(shí)間。提取結(jié)束后，過(guò)濾，取上清液，加入90%的乙醇使油茶葉多糖沉淀，離心過(guò)濾后取固相進(jìn)行干燥，即得油茶葉粗多糖。

依據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖質(zhì)量濃度，并計(jì)算多糖得率。

式中：Y—多糖得率，%;c—粗多糖溶液質(zhì)量濃度，g/L；V—粗多糖溶液的體積，mL；m—原料的質(zhì)量，g。

提取過(guò)程中分別考察了料液比(1 ∶10～1 ∶60，g ∶mL)、提取溫度(40～90 ℃)以及提取時(shí)間(10～110 s)這3個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響。

1.2.2提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，借用Desgin-Expert 10.0.4軟件，以料液比、提取時(shí)間、溫度為因素，以多糖得率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)油茶葉多糖的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化[8-10]。

1.3 油茶葉多糖的抗氧化活性測(cè)定

1.3.1DPPH·清除能力 參考文獻(xiàn)[11～12]，在100 mL容量瓶中用無(wú)水乙醇配制0.5 mmoL/L的DPPH-乙醇溶液，放冰箱中保存待用。分別配制油茶葉粗多糖質(zhì)量濃度為0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0 g/L，各取1.0 mL的DPPH-乙醇溶液，向其中加入1.0 mL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液，室溫下靜置30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用乙醇代替DPPH作為對(duì)照組測(cè)定吸光度，用蒸餾水代替多糖作為空白組測(cè)定吸光度。用相同質(zhì)量濃度的VC溶液按照上述方法進(jìn)行測(cè)定，作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.2·ABTS+清除能力 首先制備·ABTS+工作液：將濃度為7.5 mmoL/L的ABTS二銨鹽溶液和2.5 mmol/L 的過(guò)硫酸鉀溶液等體積混合，避光保存，反應(yīng)15 h，即生成·ABTS+，使用前，用無(wú)水乙醇將自由基儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，使其在734 nm波長(zhǎng)下的吸光度為0.7±0.1。參考文獻(xiàn)[13]，各取2 mL的·ABTS+工作液，再向其中分別加入0.5 mL不同質(zhì)量濃度(0.5～4.0 g/L)的多糖溶液，避光條件下反應(yīng)10 min，在734 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。用蒸餾水代替·ABTS+工作液作為對(duì)照組，用蒸餾水代替多糖溶液作為空白組。用相同質(zhì)量濃度的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.3OH·清除能力 采用Fenton體系法，分別取2.0 mL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液，向其中加入1.0 mL 5.0 mmol/L的水楊酸溶液和1.0 mL 5.0 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，搖勻后，加入1 mL 5.0 mmoL/L的H2O2和2 mL的蒸餾水，置于30 ℃水浴鍋中反應(yīng)0.5 h，在510 nm處測(cè)定吸光度。用蒸餾水作為對(duì)照樣和空白樣。用相同質(zhì)量濃度的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照[14]。

DPPH·、·ABTS+、OH·清除率(η)計(jì)算公式如下：

式中：A空白—在測(cè)定波長(zhǎng)處空白組的吸光度值；A樣品—在測(cè)定波長(zhǎng)處樣品的吸光度值；A對(duì)照—在測(cè)定波長(zhǎng)處對(duì)照組的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同提取條件對(duì)油茶葉多糖得率的影響見(jiàn)圖1。由圖1(a)可知，當(dāng)料液比為1 ∶30(g ∶mL)時(shí)，油茶葉多糖的得率最大，這主要是因?yàn)槿軇┨俨焕诙嗵堑慕佑|溶解；溶劑太多，閃式提取器中的攪拌器的阻力增大。由圖1(b)可知，當(dāng)溫度為80 ℃時(shí)多糖得率最大，這是因?yàn)闇囟忍停嗵堑娜芙馑俾实停粶囟冗^(guò)高，會(huì)導(dǎo)致多糖的分解或氧化。由圖1(c)可知，提取時(shí)間為70 s時(shí)多糖得率最大，這主要是因?yàn)闀r(shí)間過(guò)久，會(huì)導(dǎo)致多糖部分結(jié)構(gòu)被破壞。由此可見(jiàn)，單因素試驗(yàn)得到閃式提取較佳條件為：料液比1 ∶30(g ∶mL)，溫度80 ℃，提取時(shí)間70 s。

a.液料比 liquid-material ratio； b.提取溫度 extraction temperature； c.提取時(shí)間 extraction time

2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以料液比、提取溫度和提取時(shí)間為3個(gè)影響因素，以多糖得率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

利用Desgin-Expert 8.0.6軟件分析，得三元二次回歸方程：Y=8.16+0.026A+0.096B+0.15C+0.020AB-2.5×10-3AC-0.028BC-0.16A2-0.21B2-0.21C2。

2.2.2方差分析 響應(yīng)面方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，一次項(xiàng)中溫度和提取時(shí)間的影響為極顯著，料液比的影響為顯著；二次項(xiàng)中A2、B2、C2的影響為極顯著，該模型的P<0.001，表明該模型具有較好的預(yù)測(cè)性；決定系數(shù)R2為0.992 0，表明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好。校正后的決定系數(shù)R2為0.981 7，與R2接近，說(shuō)明模型有較好的準(zhǔn)確性和通用性。由F值可知，各因素對(duì)油茶葉多糖提取的影響順序?yàn)椋禾崛r(shí)間(C)>提取溫度(B)>料液化(A)。

表2 響應(yīng)面方差分析

2.2.3兩因素相互影響的響應(yīng)曲面分析 兩因素相互影響的結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2(a)可知，當(dāng)料液比一定時(shí)，多糖得率隨著溫度的升高先增加后降低，當(dāng)提取溫度為80～82 ℃，達(dá)到最大值。當(dāng)溫度一定時(shí)，多糖得率隨料液比的增加先增加后降低，當(dāng)料液比在1 ∶30～1 ∶31(g ∶mL)時(shí)達(dá)到最大值。由圖2(b)和圖2(c)可以看出，多糖得率隨著提取時(shí)間和料液比的增加先增大后減小，多糖得率隨著提取時(shí)間與提取溫度的增加亦呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。

a.Y=f(A，B)； b.Y=f(A，C)； c.Y=f(B，C)

響應(yīng)面3D圖中曲面越陡峭，說(shuō)明兩因素的交互作用對(duì)油茶葉多糖提取得率的影響越顯著。由圖可知，BC的曲面最為陡峭，即在油茶葉閃式提取多糖工藝中，溫度與提取時(shí)間的交互作用對(duì)提取效果的影響最為顯著。各因素交互影響的順序?yàn)椋築C>AB>AC。

用Desgin-Expert 10.0.4軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)油茶葉多糖的最佳提取工藝為：料液比1 ∶30.89(g ∶mL)，提取溫度81.46 ℃，提取時(shí)間73.41 s，預(yù)測(cè)得率為8.07%。考慮實(shí)際可行性，調(diào)整為料液比1 ∶30(g ∶mL)，提取溫度81 ℃，提取時(shí)間75 s，在此條件下，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，油茶葉多糖得率分別為8.35%、 8.44%、 8.50%，平均得率為8.43%，與預(yù)測(cè)值相近，表明模型具有很好的預(yù)測(cè)性。

2.3 油茶葉粗多糖的抗氧化性

對(duì)提取的油茶葉粗多糖進(jìn)行抗氧化活性測(cè)試，結(jié)果如圖3所示。由圖可見(jiàn)油茶葉粗多糖對(duì)DPPH·的清除能力與多糖濃度有一定的量效關(guān)系，隨著多糖濃度的增大，清除率增大，IC50值為1.706 g/L。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為2.5 g/L時(shí)，DPPH·清除率大于80%，清除能力顯著，與VC相近。

a.DPPH·； b.·ABTS+； c.·OH

在低濃度下，油茶葉粗多糖對(duì)·ABTS+的清除率與深度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，隨著油茶葉粗多糖濃度的增加，對(duì)·ABTS+的清除能力也逐漸增加，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1.5 g/L時(shí)，清除能力達(dá)到72.35%，IC50值為0.826 g/L，粗多糖同濃度下清除能力略低于VC，表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除能力。

油茶葉粗多糖對(duì)·OH的清除能力也隨著濃度的增大而增強(qiáng)，IC50值為4.811 g/L，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為5.0 g/L時(shí)，清除率達(dá)到58.35%，雖然清除率低于VC，但仍表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除能力[15]。

3 結(jié) 論

3.1以油茶葉為原料，蒸餾水為溶劑，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上以料液比、溫度、提取時(shí)間為因素，以油茶葉多糖得率為響應(yīng)值，借助Desgin-Expert 10.0.4軟件設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，對(duì)油茶葉多糖閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：較佳工藝為料液比1 ∶30(g ∶mL)，提取溫度81 ℃，提取時(shí)間75 s，此條件下油茶葉多糖得率為8.43%。

3.2較優(yōu)條件下提取的油茶葉粗多糖對(duì)DPPH·、·ABTS+、OH·都有很好的清除能力，IC50值分別為1.706、 0.826和4.811 g/L，雖然略小于VC的清除能力，但仍表現(xiàn)出很強(qiáng)的體外抗氧化活性。