微生物轉化粗甘油制備高附加值產品的研究進展

姜莉莉, 朱寶偉, 李昌麗,3, 楊 薇, 劉鳳翊*

(1.營口理工學院 化學與環境工程學院,遼寧 營口 115014； 2.江蘇省生物質能源與材料重點實驗室,江蘇 南京 210042； 3.遼寧省化學助劑合成與分離重點實驗室,遼寧 營口 115014)

隨著石油資源日益枯竭、環境污染嚴重，生物柴油作為可再生能源越來越受到人們的重視。利用動物或植物油脂與醇類發生酯交換反應生產生物柴油，其副產物甘油占生物柴油總產量的10%[1]，粗甘油過剩問題亟待解決。因此，將粗甘油轉化為高附加值產品，不僅可以使生物煉制企業獲得利潤，也利于生物柴油產業的可持續發展[2]。隨著甘油價格不斷下降，通過微生物發酵法將粗甘油轉化為各種生物基化學品受到了人們的重視[3]。甘油是微生物生長的重要底物，能夠產生1,3-丙二醇、乙醇、乳酸、二羥基丙酮、氫氣、琥珀酸等生物基化學品[3-7]。盡管通過微生物發酵法生產生物基化學品需要面對化學合成法的激烈競爭，但由于其潛在的巨大經濟效益，使以粗甘油為碳源的微生物發酵生產綠色化工產品成為研究熱點[7]。生物柴油生產過程中的副產物粗甘油常常含有廢催化劑、甲醇、皂化物、游離脂肪酸、無機鹽等雜質，限制了其在工業生產中的應用[8]。為了滿足現有使用的要求，需要對粗甘油進行純化去除雜質，然而其提純過程復雜，成本較高，不具有經濟可行性。因此，利用微生物發酵法將粗甘油轉化為各種高附加值產品是實現可持續發展的重要途徑。本文重點介紹了微生物發酵技術轉化粗甘油的代謝途徑及應用，以期為后續粗甘油經微生物發酵技術轉化獲得高質量、高附加值化學品提供借鑒和參考。

1 甘油微生物發酵的代謝途徑

以甘油為碳源的常見菌屬為梭菌屬(Clostridium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella) 、乳桿菌屬(Lactobacillus)、油脂酵母菌屬(Lipomyces)、埃希氏菌屬(Escherichia)和念珠菌屬(Candida)等，這些微生物可以在好氧或厭氧條件下，將甘油轉化生產多種生物基化學品[3-7]。同時，基因工程菌也被廣泛研究來提高目標產物的產量[9]。肺炎克雷伯氏桿菌(K.pneumoniae)屬于兼性厭氧菌，可以在有氧和厭氧條件下分別通過glp和dha兩種操縱子代謝甘油，glp操縱子編碼的兩種酶分別為甘油激酶和甘油-3-磷酸脫氫酶,dha操縱子編碼的4種酶分別為甘油脫氫酶(GDH)、二羥丙酮激酶(DHAK)、甘油脫水酶(GDHt)和1,3-丙二醇氧化還原酶(PDOR)。甘油在肺炎克雷伯氏桿菌中的代謝過程(圖1)可以側面反映微生物轉化甘油生產高附加值產品的關鍵酶和主要代謝途徑。

NADH2:還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NAD+:氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸oxidized nicotinamide adenine dinucleotide;ADP:腺苷二磷酸adenosine diphosphate；ATP:腺苷三磷酸adenosine triphosphate；GDHt:甘油脫水酶glycerol dehydratase;GDH:甘油脫氫酶glycerol dehydrogenase;PDOR:1,3-丙二醇氧化還原酶1,3-propanediol oxidoreductase;DHAK:二羥丙酮激酶dihydroxyacetone kinase

代謝途徑包括有氧代謝途徑和厭氧代謝途徑。有氧代謝途徑是指在有氧條件下，進入微生物細胞內的甘油被甘油激酶催化生成甘油-3-磷酸(G3P)，G3P會進一步被甘油-3-磷酸脫氫酶轉化為二羥基丙酮磷酸(DHAP)，然后由磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，再通過乙酰輔酶A進入三羧酸循環(TCA)轉化成各種代謝產物(如檸檬酸、琥珀酸、甲酸、蘋果酸等)，并為微生物提供能量(鳥嘌呤核苷三磷酸(GTP))和還原當量(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH2)和還原型黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH2))[10]。厭氧途徑是指在厭氧條件下，甘油進入微生物細胞后發生歧化反應，包括氧化和還原兩條途徑。在還原途徑中，甘油首先在甘油脫水酶(GDHt)的催化下生成3-羥基丙醛(3-HPA)，然后由NADH2依賴的1,3-丙二醇氧化還原酶(PDOR)還原為1,3-丙二醇。在氧化途徑中，甘油在甘油脫氫酶(GDH)的作用下脫氫生成二羥基丙酮，同時生成還原力NADH2。二羥基丙酮進一步被二羥丙酮激酶(DHAK)磷酸化生成二羥基丙酮磷酸并進入糖酵解途徑，通過該途徑會產生乙醇、乳酸、乙酸、甲酸、2,3-丁二醇等產物，同時產生還原力NADH2和能量用于微生物的生長和還原產物的合成[11]。已有研究表明微量氧氣的存在，不僅不會抑制dha操縱子的表達，而且還會在一定程度上提高還原產物1,3-丙二醇的產量，可見氧氣對甘油在微生物中的代謝途徑具有重要的調節作用[12]。

2 粗甘油的微生物發酵產物

2.1 1,3-丙二醇

1,3-丙二醇(1,3-PD)可以作為單體合成聚酯、聚醚和聚氨酯等多種聚合物，其在紡織、醫藥、化妝品、涂料、溶劑等領域具有廣泛的應用。生物法生產1,3-PD可以避免使用昂貴催化劑和高溫高壓的條件，以及有毒中間產物的產生，因而微生物轉化法生產1,3-PD受到廣泛重視。自然界中，常見的用于微生物轉化甘油生產1,3-PD 的菌屬包括克雷伯氏菌屬[13-15]、腸桿菌屬(Enterobacter)[16]、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)[17]、梭菌屬[18-19]和乳桿菌屬[20]。

在微生物細胞內甘油通過歧化作用轉化為還原產物1,3-PD，以及氧化產物乙醇等醇類和乳酸等有機酸[11]。傳統發酵法主要是利用天然菌株或者基因工程菌等微生物通過純培養法轉化純甘油生產1,3-PD[21]。隨著粗甘油產量的逐年增加，為了降低生物法生產1,3-PD的成本，研究者不斷嘗試利用粗甘油作為底物發酵生產1,3-PD。但是由于粗甘油中的雜質往往會抑制微生物的生長，傳統的純種發酵技術很難高效利用粗甘油，從而造成了底物轉化率和產物濃度均較低等缺點。微生物菌群發酵技術由于具有可利用復雜基質、代謝產物可調控、適應性強等優點，促使研究者不斷嘗試利用微生物菌群發酵代替傳統的純種發酵[22]。不同微生物轉化甘油生產1,3-PD的性能比較見表1。

表1 不同微生物轉化甘油生產1,3-丙二醇的性能比較

由表1可知，與純種發酵相比,利用微生物菌群發酵粗甘油生產1,3-PD不僅轉化率相當，而且可以在不滅菌的條件下進行操作，大大降低了生產成本。Jiang等[26]從潮間帶污泥中篩選可以轉化粗甘油生產1,3-PD的微生物菌群CJD-S，通過對發酵條件的優化，在不滅菌條件下進行批次流加粗甘油實驗，最終1,3-PD的質量濃度可以達到41.47 g/L，并生成45.86 g/L乳酸，此研究對利用粗甘油生產高附加值生物基化學品具有一定參考價值。

2.2 生物乙醇

生物乙醇因具有能量密度高、易于運輸、可再生性好等特點已成為全世界最主要的生物能源之一。生物乙醇生產的主要原料包括：甘蔗、甜菜、甜高粱等含糖作物，玉米、小麥、高粱、木薯、紅薯、馬鈴薯及菊芋等淀粉質作物，以及秸稈、木屑、農作物殼皮及城鄉固體垃圾等木質纖維質原料[27]。目前生物乙醇的生產存在與人爭糧、生產成本高等問題，為拓展原料來源、保護環境、進一步提高生物乙醇的市場競爭力，利用甘油作為原料來降低生物乙醇的生產成本逐漸得到研究人員的關注[28]。

常用于轉化甘油生產乙醇的微生物包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、肺炎克雷伯氏桿菌等(表2)。在微生物中常利用由二羥基丙酮磷酸(DHAP)介導的代謝途徑轉化甘油生產乙醇：氧化途徑由甘油脫氫酶和二羥基丙酮激酶催化，還原途徑由甘油-3-磷酸脫氫酶和激酶催化[35]。已有研究表明以粗甘油為原料發酵生產乙醇在成本上會節約40%左右，將大大提高生物乙醇的市場競爭力[36]。在好氧條件下，通過聚冷凝膠固定嗜鞣管囊酵母菌(PachysolentannophilusY-475)生產乙醇，產量可達90%[5]。在厭氧條件下，大腸桿菌(E.coliATCC 11505)能夠抵抗甘油抑制作用，耐受高濃度甘油[37]。乙醇的發酵生產還受到碳源、pH值、代謝物、溫度等因素的影響，雖然甘油發酵產率高，但存在甘油消耗速度慢、生產強度低等缺點，為此人們利用微生物菌群和基因工程菌等方法來解決此類問題，以期實現工業化生產[29-30,33]。Maru等[38]通過共培養大腸桿菌CECT 432和腸桿菌spH1構建人工菌群來提高微生物利用粗甘油生產乙醇和氫的轉化率。有研究將載有醛醇脫氫酶(AdhE)基因的質粒導入肺炎克雷伯氏桿菌BLh-1中，在以粗甘油為底物的批次流加發酵實驗中，乙醇的終質量濃度達到了17.30 g/L，生產強度和轉化率分別達到了0.59 g/( L·h)-1和16%，與野生菌相比，乙醇的產量增加了11.5 %[39]。Tao等[40]敲除了產酸克雷伯菌作用下甘油氧化代謝途徑中乙酸和還原途徑中1,3-PD的合成基因后，在以甘油和葡萄糖酸鹽為共底物時，乙醇的產率從62%增加到了97.2%。也有研究通過在發酵培養基中添加酪蛋白水解液或金槍魚冷凝液來提高微生物轉化粗甘油生產乙醇的濃度和轉化率，進一步降低生物乙醇的生產成本[41-42]。

表2 不同微生物轉化甘油生產乙醇的性能比較

2.3 乳 酸

乳酸(2-羥基丙酸)是一種含有羧基和羥基的雙功能分子，作為一種平臺化合物，常用于生產聚乳酸、乙醛、丙烯酸、2,3-乙酰基丙酮等聚合物和化學品，廣泛應用于食品、化妝品、制藥等行業。乳酸具有手性中心，存在L-乳酸和D-乳酸兩種異構體。由于化學法合成的乳酸常常需要高溫和高壓等條件，并產生外消旋混合物，因此可以生產光學純乳酸的微生物發酵法一直受到人們的重視[43]。自然界中，克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬(Enterococcus)和根霉菌屬(Rhizopus)等微生物能利用甘油產生高濃度的乳酸[8,44-45]。電化學已被應用于微生物轉化甘油生產乳酸的發酵過程中，產生的電場通過氧化或還原的方式影響發酵環境和微生物代謝活動，進而提高乳酸的產量和甘油的轉化率[46]。Feng等[9]利用基因工程菌肺炎克雷伯氏桿菌(K.pneumoniae)過表達D-乳酸脫氫酶(LdhA)，并敲除與1,3-PD 合成相關的兩個基因dhaT和yqhD，從而使光學純D-乳酸達到142.1 g/L，轉化率為90%。為了克服粗甘油雜質對純培養微生物的抑制作用，Wang等[6]從活性污泥中篩選微生物菌群轉化粗甘油生產1,3-PD和乳酸。通過間歇發酵實驗發現：與單菌相比，微生物菌群發酵表現出優越的底物耐受性和發酵性能，最終在微氧和不滅菌條件下獲得27.77 g/L 1,3-PD和14.68 g/L乳酸。Murakami等[47]通過在底物中加入少量的乙酸來提高乳酸的產量，在批次流加發酵實驗中于30 g/L甘油和10 g/L乙酸的條件下，L-乳酸的濃度和甘油的轉化率分別達到55.3 g/L和0.991 mol/mol。

2.4 1,3-二羥基丙酮

1,3-二羥基丙酮是合成多種精細化學品和生物可降解聚合物的重要前體，具有促進大腦發育、保護視力和預防心臟病等功效，在化妝品、食品、醫藥等行業有廣泛的應用[48]。由于甘油價格低廉，與化學合成法相比微生物發酵法生產1，3-二羥基丙酮更具經濟性和安全性[49]。多種天然微生物和基因工程菌可以利用粗甘油生產1，3-二羥基丙酮，包括葡糖桿菌屬(Gluconobacter)、葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobacter)等細菌；裂壺藻屬(Schizochytrium)等藻類；畢赤酵母菌屬(Pichia)等真菌[50]。葡糖桿菌屬是目前生產1，3-二羥基丙酮應用最廣泛的微生物，其可以通過膜結合的甘油脫氫酶催化甘油不完全氧化生產1，3-二羥基丙酮。該類微生物在需氧條件下生長，對氧氣的需求相對較高。為了提高氧傳遞效率進而提高1，3-二羥基丙酮的產量，人們深入探究了生物反應器的構型、培養基的理化性質以及菌株等參數。Zhou等[51]利用壓縮供氧密封攪拌反應器培養氧化葡萄糖酸桿菌(G.oxydansNL71)，在發酵32 h后轉化粗甘油生產1,3-二羥基丙酮的質量濃度可達到(301.2±8.2) g/L，生產強度為(9.41±0.23) g/(L·h)。

3 結 語

隨著生物柴油產業的迅速發展，其副產物粗甘油已出現供過于求的局面，由于粗甘油中存在多種雜質導致其利用價值較低。基于微生物法具有作用條件溫和、綠色環保、可持續發展等特點，因此利用微生物轉化粗甘油生產高附加值產品越來越受到人們的重視。由于粗甘油成分復雜，所含雜質常常抑制微生物生長，因此，如何提高微生物對粗甘油的耐受性和轉化能力是實現以粗甘油為底物的關鍵問題。與傳統微生物純種發酵相比，微生物菌群發酵具有可利用復雜原料、代謝產物可調節、不需要嚴格的無菌環境、適應性強等優點，因此基于微生物菌群的發酵技術有望解決廉價原料難以利用、底物轉化率低、副產物多、發酵和分離成本高等產業化難題，為生物基化學品的工業化生產提供了新的技術路線，是今后廉價基質高效利用的研究方向和重點。