lncRNA CTD-2066L21.1的表達在胃癌順鉑耐藥中的作用

朱潔潔，顧康生

(安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤內科，安徽 合肥 230032)

0 引言

最新全球數據顯示，胃癌(GC)是全球第五個最常見的腫瘤和腫瘤患者死亡的第三大原因[1]，是一個危害人類健康的重大疾病。胃癌的治療方式包括手術、化療、分子靶向治療等，盡管胃癌治療取得了一些進展，很多胃癌患者的生存期得以延長，但大多數胃癌中晚期患者仍預后較差，其中與化療耐藥的產生息息相關。鉑類為胃癌化療的一線藥物之一，探究其耐藥相關分子標志物，對改善胃癌預后至關重要。近年來國內外已有不少研究證實lncRNAs與胃癌預后相關，且參與了胃癌化療耐藥。本研究前期通過比較胃癌順鉑耐藥細胞SGC7901/DDP與其親本細胞SGC7901之間lncRNA表達譜的差異，篩選出可能與GC細胞中鉑類藥物耐藥密切相關的lncRNA CTD-2066L21.1，本研究旨在繼續探討其在胃癌鉑類耐藥細胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

總RNA提取試劑TRIZOL購自美國Invitrogen公司；lncRNA 逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑以及敲低、過表達慢病毒載體均購自上海吉瑪制藥技術公司；人類胃癌細胞株SGC7901，和人胃黏膜上皮細胞 GES-1，均從中國科學院(上海)細胞庫獲得；對順鉑耐藥的SGC7901/DDP細胞購于南京凱基生物科技發展有限公司；10%胎牛血清、鏈霉素(100 g/mL)和青霉素(100 U/mL)、RPMI-1640細胞培養基購自美國 Gibco 公司；MTT、DMSO 購自美國 sigma公司；DEPC 水購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 細胞培養

將細胞保存在含10%胎牛血清、鏈霉素(100g/mL)和青霉素(100U/mL)的RPMI-1640細胞培養基中，放置于37℃、5% CO2的培養箱中。為了維持順鉑耐藥表型，將終濃度為800 ng/mL的順鉑加入到SGC7901/DDP細胞的培養基中。實驗前將SGC7901/DDP細胞在無順鉑的培養基中培養一周。

1.3 RNA提取及定量

嚴格按照TRIZOL試劑操作說明提取人GC細胞的總RNA。PBS清洗3次細胞后加入TRIZOL試劑，冰上操作，吹打混懸后轉移至1.5mL EP管中，加入氯仿充分振蕩，于室溫下放置5min后離心，取上清液，加入預冷異丙醇，混勻后再離心，棄上清，加入無水乙醇洗滌沉淀2次，室溫干燥沉淀，加入適量的DEPC水溶解稀釋。取少量RNA溶液，用Nanodrop 2000紫外分光光度計檢測其濃度和純度。當A260/A280比值在1.8～2.0之間時，RNA純度較好。用DEPC稀釋定量RNA。

1.4 RT-PCR 檢測

lncRNA的RT-PCR按照RT-qPCR定量試劑盒(Gene Pharma)的說明書進行，合成cDNA 第一鏈后，將反應體系置于逆轉錄儀(LightCycler480)上，進行PCR擴增。lncRNA CTD-2066L21.1的表達水平通過2-ΔΔCt表達。ΔCt為同一樣本中目的基因與內參基因(β-actin) Ct 值的差值。

1.5 慢病毒轉染

將對數生長期的細胞接種在12孔板的培養板中，當細胞匯合度30%-50%時，除去舊培養基，繼續接種在不含血清及雙抗的培養基，將構建好的敲低或過表達lncRNA CTD-2066L21.1慢病毒載體(含有目的片段、GFP 熒光標記、抗嘌呤霉素耐藥基因)，加入培養孔中。24 h 后，吸去孔中含有慢病毒的培養基，加入新鮮完全培養基進行細胞培養。72 h 后，在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白 GFP 的表達，評估轉染效率。利用嘌呤霉素篩選轉染的細胞以獲得純種的轉染細胞，RTPCR法驗證細胞目的基因過表達或敲低的效率；培養、傳代、保種，進行后續實驗。

1.6 細胞活性分析

將SGC7901/DDP細胞接種于96孔板上。24h后，順鉑濃度分別為40、20、2、0.2、0.02和0.002μg/mL處理SGC7901/DDP細胞48h。20μl MTT (5 mg/mL；SIGMA)被加入每個槽中。孵育4 h后，加入150μl二甲基亞砜(SIGMA)，輕輕搖勻10min。測定490 nm處的吸光度。利用SPSS 19.0軟件根據細胞活性計算順鉑的半抑制濃度(IC50)。所有操作至少重復三次，結果取平均值。

1.7 流氏細胞儀分析

采用膜聯蛋白V-FITC/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒(BestBio)，通過流式細胞術(FCM)檢測SGC7901/DDP和SGC7901細胞的凋亡率。對SGC7901/DDP細胞和SGC7901細胞(～1×106細胞)分別用終濃度為0.8和0.3 g/mL的順鉑處理。在37℃下處理48h后，收集細胞并用冰PBS洗滌兩次。用400 μL的1×結合緩沖液重懸細胞，密度最終維持在1×106個細胞/mL左右。加入5μL膜聯蛋白V-FITC，室溫避光下孵育15 min。然后在懸液中加入10μL PI，在室溫黑暗下孵育5min。最后，使用Gallios流式細胞儀檢測細胞凋亡情況(早期+晚期)。

1.8 統計學分析

數據采用SPSS 19.0軟件進行分析。采用t檢驗(兩組)或單因素方差分析(ANOVA，超過兩組)來確定變量之間的差異。P值<0.05時認為差異有統計學意義。使用Graphpad軟件8.0繪制相關圖表。

2 結果

2.1 lncRNA CTD-2066L21.1 在 SGC7901/DDP 細胞中明顯上調

本課題組前期將胃癌細胞株和胃癌耐藥細胞株中利用博奧晶芯 LncRNA+mRNA Human Gene Expression Microarray V4.0，4×180K 芯片進行檢測分析，發現在胃癌耐藥細胞株SGC7901/DDP中下調的有223種，上調的有187種，這其中就包括上調的p13641(CTD-2066L21.1)(P<0.05，差異倍數≥2)。之后我們進行RT-PCR法檢測，lncRNA CTD-2066L21.1在胃癌耐藥細胞株 SGC7901/DDP中的表達顯著高于胃癌親本細胞株 SGC7901，差異有統計學意義(P<0.001)，與芯片檢測結果一致。因此，我們猜測lncRNA CTD-2066L21.1與胃癌順鉑耐藥有關。

圖1 lncRNA CTD-2066L21.1 在 SGC7901/DDP 細胞中明顯上調。

2.2 慢病毒轉染

為了進一步探討lncRNA CTD-2066L21.1與胃癌順鉑耐藥之間的關系，本研究通過重組慢病毒過表達載體CTD-2066L21.1-mimic，轉染原本低表達的SGC7901細胞，用CTD-2066L21.1-siRNA下調SGC7901/DDP細胞中的CTD-2066L21.1表達，之后用嘌呤霉素篩選、RT-PCR驗證，構建穩定過表達和低表達細胞株。如圖2A所示，RT-PCR結果示轉染后的SGC7901細胞(SGC7901-CTD-2066L21.1-OE)CTD-2066L21.1表達量顯著高于普通未轉染的胃癌親本對照細胞(SGC7901)和對照載體(SGC7901-NC)(P<0.001)，說明過表達細胞株構建成功；用CTD-2066L21.1-siRNA轉染三種SGC7901/DDP細胞，發現與SGC7901/DDP-CTD-184，和SGC7901/DDP-CTD-254相比，轉染后的分析結果顯示SGC7901/DDP-CTD-121敲除效率最佳(圖2B，P<0.01)，因此后續選擇SGC7901/DDPCTD-121繼續接下來的研究。

圖2 建立穩定細胞株

2.3 細胞活力檢測

接下來我們通過細胞活力檢測研究過表達CTD-2066L21.1對SGC7901/DDP細胞順鉑耐藥性的影響。在體外分別以不同濃度的順鉑處理各組SGC7901/DDP細胞，48h后檢測細胞活力。結果顯示：過表達CTD-2066L21.1后，SGC7901細胞的活力明顯增強；過表達組的半數抑制濃度(IC50)顯著高于陰性對照組(SGC7901-NC)和空白對照組(SGC7901)(圖3A，P<0.01)，差異有統計學意義。而在胃癌耐藥細胞中，敲除CTD-2066L21.1后，SGC7901/DDP-CTD-KD 細胞對順鉑敏感性增加；過表達組的半數抑制濃度(IC50)顯著低于陰性對照組(SGC7901/DDP-NC)和空白對照組(SGC7901/DDP)(圖3B，P<0.01)，以上結果表明，CTD-2066L21.1的上調可降低胃癌細胞對順鉑的敏感性，其下調能逆轉胃癌順鉑耐藥細胞對順鉑的耐藥性。

圖3 (A)上調lncRNA CTD-2066L21.1可降低SGC7901細胞對順鉑的敏感性；P<0.01。(B)敲除lncRNA CTD-2066L21.1逆轉了SGC7901/DDP細胞中的順鉑耐藥；P<0.01。

2.4 流式細胞儀分析

為了進一步驗證，用流式細胞儀分析顯示SGC7901細胞和SGC7901/DDP在順鉑治療48h后(最終濃度為1μg/mL)的凋亡率。結果與細胞活力實驗結果一致，敲除lncRNA CTD-2066L21.1后的SGC7901/DDP細胞對DDP誘導的凋亡敏感性增加，凋亡率升高(P<0.001)；而上調lncRNA CTD-2066L21.1使SGC7901細胞順鉑誘導的凋亡細胞率減少，耐藥性增加(P<0.001)。

圖4 (A) 敲除lncRNA CTD-2066L21.1使SGC7901/DDP細胞對DDP誘導的凋亡敏感；P<0.001。(B) lncRNA CTD-2066L21.1上調使SGC7901細胞順鉑誘導的凋亡減少；P<0.001。

3 討論

胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤，居我國常見惡性腫瘤發病率第2位和死亡率第3位，是一個重大的公共衛生問題。早期胃癌治療的首選的主要方式是根治性手術切除，但對于中晚期癌癥患者，手術不能完全切除病變。化療是人類胃癌術后的主要治療策略，它可以一定程度上延長患者生存期、改善預后。然而化療耐藥的產生極大地影響了療效。探究其分子標志物，同時尋找化療耐藥分子靶標成為研究熱點。

lncRNAs是一種長度大于200個核苷酸但缺乏蛋白編碼能力的長鏈非編碼RNA[2]。lncRNAs在哺乳動物中主要由RNA聚合酶(RNAP) II或III轉錄，在植物中主要由RNAP IV和V轉錄[3,4]。由于高通量RNA測序(RNA-seq)方法的廣泛應用，在哺乳動物和植物等許多生物體內發現了成千上萬的lncRNAs。lncRNAs的功能包括基因印記、組蛋白修飾、染色質重構、轉錄激活、轉錄干擾、核轉運、調節細胞周期等[5-9]。

近年來國內外已有不少研究證實lncRNAs在胃癌中廣泛表達，并影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移及對化療的療效。MORIDI H[10]研究發現lncRNA NONHSAT062994在GC樣本組織中表達下調，并與組織學分級和腫瘤大小顯著相關，與年齡、性別、TNM分期、淋巴結轉移、血管轉移和壞死無關。Hongbing Zhai[11]發現胃癌組織和細胞系中lncRNA BCYRN1-27表達顯著升高，其中29例胃癌患者BCYRN1 - 27表達與腫瘤深度、淋巴結轉移及臨床分期呈正相關，單因素和多因素Cox回歸分析顯示，高BCYRN1- 27表達是胃癌患者生存的獨立預后因素。Wang L[12]在細胞學實驗中發現lncRNA 4(BCAR4)在順鉑耐藥細胞株(SGC7901/DDP)中的表達增強；BCAR4在SGC7901細胞中的過度表達增加了對順鉑的耐藥性，而降低BCAR4在SGC7901/DDP細胞中的表達，會提高對順鉑的敏感性。

CTD-2066L21.1 是一種基因間長鏈非編碼 RNA，它是已知的新型 RNA，目前功能尚不明確。關于lncRNA CTD-2066L21.1在胃癌中的表達及其與細胞耐藥的影響，相關文獻報道非常少。本課題組前期通過芯片檢測分析發現相比較普通胃癌細胞株，CTD-2066L21.1在胃癌耐藥細胞株 SGC7901/DDP 中明顯上調，由此我們推測CTD-2066L21.1 可能與胃癌細胞順鉑耐藥性有著密切的關聯。RT-PCR結果證實lncRNA CTD-2066L21.1在SGC7901/DDP中的表達顯著高于SGC7901，后通過重組慢病毒載體轉染，在SGC7901中過表達lncRNA CTD-2066L21.1，細胞對順鉑耐藥性增強，凋亡率降低。而在SGC7901/DDP細胞中敲低lncRNA CTD-2066L21.1表達后，細胞的活性降低，凋亡率升高。因此，lncRNA CTD-2066L21.1的表達與胃癌順鉑耐藥相關，可能成為胃癌鉑類耐藥潛在的分子標志物。

4 結論

lncRNA CTD-2066L21.1上調可使胃癌細胞對順鉑敏感性降低，其下調可逆轉SGC7901/DDP細胞的順鉑耐藥性。