特戊酸檸檬酯對(duì)植物病原真菌的抑菌活性

關(guān)曄晴，陳紅兵，劉慧平，韓巨才

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西 太谷 030801）

基于環(huán)境和諧農(nóng)藥這一理念的不斷發(fā)展，從微生物代謝產(chǎn)物中尋找發(fā)現(xiàn)新型先導(dǎo)化合物，是生物農(nóng)藥研制的一個(gè)重要方向[1-4]。放線菌是一類重要的微生物資源，目前，大約有超過2/3的抗生素類物質(zhì)來自于放線菌的次生代謝物質(zhì)[5-7]，如井岡霉素、春雷霉素、多效霉素、農(nóng)抗120、中生菌素等在植物病害防治上已被廣泛應(yīng)用[8-9]。特戊酸檸檬酯（Neryl pivalate）是在前期研究1株辣椒內(nèi)生婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces rochei）代謝產(chǎn)物的抑菌活性試驗(yàn)中合成的一種化合物[10]。特戊酸酯類具有抗水解性和特定芳香氣味，作為工業(yè)香料，可用作香皂、洗發(fā)水、發(fā)膠等香味添加劑，在醫(yī)藥工業(yè)中，用于制造若干緩釋類藥劑[11-12]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)其抗真菌活性方面還未見有報(bào)道。

本試驗(yàn)以特戊酸檸檬酯為研究對(duì)象，測(cè)定了其對(duì)6種常見植物病原真菌的抑制作用，并分析了對(duì)病菌菌絲、孢子形態(tài)的影響，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，將其開發(fā)成為生物農(nóng)藥新品種提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯 200g，葡萄糖 20g，瓊脂 20g，水1000 mL。

1.1.2 供試病原菌 番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、梨黑斑病菌（Alternaria alternata）、小麥葉枯病菌（Alternaria triticina），均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 供試藥劑 特戊酸檸檬酯（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室合成）、丙酮（天津市化學(xué)試劑六廠生產(chǎn)）、Tween80（天津市北辰方正試劑廠生產(chǎn)）、50%多菌靈可濕性粉劑（海南江河農(nóng)藥化工有限公司生產(chǎn)）、75%甲基托布津可濕性粉劑（日本曹達(dá)株式會(huì)生產(chǎn)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 特戊酸檸檬酯對(duì)6種病原菌菌絲抑制作用的測(cè)定 采用FAO推薦的菌落直徑法[13]。將特戊酸檸檬酯用體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮溶液溶解，用無菌水分別稀釋為 112，224，336，448，896 mg/L，再將各藥液分別與PDA培養(yǎng)基按1∶9的比例混合制備含藥平板。在各平板上分別接入直徑5 mm的供試6種病原菌新鮮菌塊，在25℃條件下培養(yǎng)5 d后，測(cè)定不同質(zhì)量濃度下各處理的菌落直徑。3次重復(fù)，以含體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮為對(duì)照。用DPS 6.0軟件分析毒力回歸方程式、EC50值和95%置信限。

1.2.2 特戊酸檸檬酯對(duì)6種病原菌孢子抑制作用的測(cè)定 其測(cè)定采用懸滴法[14]。制備孢子懸浮液，將特戊酸檸檬酯配制的 31.25，62.5，125，250，500mg/L藥液分別與等體積的孢子懸浮液混合，保濕培養(yǎng)，于12，24 h后在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)情況，以芽管長(zhǎng)度超過孢子直徑1/2計(jì)為萌發(fā)。5次重復(fù)，以無菌水為對(duì)照。

1.2.3 特戊酸檸檬酯與2種殺菌劑毒力差異的測(cè)定 分別將50%多菌靈可濕性粉劑、75%甲基托布津可濕性粉劑制成10000mg/L的母液，再根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果將各藥劑分別用無菌水稀釋為5個(gè)不同的梯度，將各藥液分別與PDA培養(yǎng)基按1∶9混合制備含藥平板。在平板上分別接入直徑為5 mm的番茄早疫病菌和梨黑斑病菌新鮮菌塊，25℃恒溫培養(yǎng)5 d后，測(cè)定不同梯度下各處理的菌落直徑。3次重復(fù)，以無菌水為對(duì)照。

1.2.4 特戊酸檸檬酯對(duì)病原菌菌絲、孢子形態(tài)的影響 挑取6種新鮮病原菌菌絲分別與250mg/L特戊酸檸檬酯藥液混合，于凹玻片中25℃保濕培養(yǎng)。在12，24，48 h時(shí)鏡檢（400×）孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)情況。以無菌水為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 特戊酸檸檬酯對(duì)6種病原菌菌絲生長(zhǎng)影響

由表1可知，特戊酸檸檬酯對(duì)6種病原菌菌絲的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，其EC50在338.72～829.20mg/L之間，其中對(duì)辣椒枯萎病菌的抑制作用最強(qiáng)，EC50為338.72 mg/L；其次為小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌，其EC50分別為406.01，426.61 mg/L；對(duì)其余3種鏈格孢屬病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用較弱，EC50在678.05～829.20mg/L之間。這表明特戊酸檸檬酯對(duì)不同病原菌的抑菌活性存在較大差異，但抗菌譜較廣。

表1 特戊酸檸檬酯對(duì)6種病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.2 特戊酸檸檬酯對(duì)6種病原菌孢子萌發(fā)影響

從表2可以看出，特戊酸檸檬酯可不同程度抑制6種病原菌的孢子萌發(fā)，對(duì)番茄早疫病菌的抑制作用最強(qiáng)，EC50為59.63 mg/L；對(duì)番茄灰霉病菌、梨黑斑病菌、小麥赤霉病菌和辣椒枯萎病菌的作用次之，EC50分別為 87.89，91.56，108.62，115.57 mg/L；對(duì)小麥葉枯病菌孢子萌發(fā)的抑制作用最弱，EC50為131.69 mg/L。表明特戊酸檸檬酯對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用強(qiáng)于對(duì)病原菌菌絲，但其大小與對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制規(guī)律有所不同。

表2 特戊酸檸檬酯對(duì)6種病原菌孢子萌發(fā)的影響

2.3 特戊酸檸檬酯與2種殺菌劑的毒力差異比較結(jié)果

從表3可以看出，特戊酸檸檬酯抑制番茄早疫病菌和梨黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50分別為678.05，760.83 mg/L；甲基托布津?qū)?種病菌的EC50分別為58.89，47.04 mg/L；多菌靈對(duì)2種病菌的EC50分別為643.38，1208 .87 mg/L；與甲基托布津相比，特戊酸檸檬酯對(duì)2種病菌的EC50較高；而與多菌靈相比，特戊酸檸檬酯對(duì)番茄早疫病菌的EC50接近于多菌靈，但對(duì)梨黑斑病菌的EC50明顯小于多菌靈，且存在顯著性差異。說明特戊酸檸檬酯對(duì)梨黑斑病菌的抑菌效果優(yōu)于廣譜性殺菌劑多菌靈，有進(jìn)一步開發(fā)為農(nóng)藥的應(yīng)用價(jià)值。

表3 特戊酸檸檬酯與2種殺菌劑的毒力差異比較

2.4 特戊酸檸檬酯對(duì)病原菌菌絲、孢子形態(tài)的影響

研究結(jié)果（圖1）表明，經(jīng)特戊酸檸檬酯處理的病原菌菌絲（以小麥葉枯病菌為例）扭曲變形，部分菌絲斷裂，菌絲隔膜不明顯，原生質(zhì)濃縮；經(jīng)特戊酸檸檬酯處理的病原菌孢子不能正常萌發(fā)，部分畸形，出現(xiàn)皰疹樣突起（圖1-A）。而對(duì)照組菌絲體正常發(fā)育，隔膜明顯，原生質(zhì)分布合理；病菌孢子正常發(fā)育萌發(fā)，12 h后即可產(chǎn)生菌絲（圖1-B）。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)試驗(yàn)得出，特戊酸檸檬酯對(duì)辣椒枯萎病菌、小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、梨黑斑病菌、小麥葉枯病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，且對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用普遍強(qiáng)于對(duì)菌絲生長(zhǎng)，其中，對(duì)番茄早疫病菌的孢子萌發(fā)抑制作用最強(qiáng)，EC50為59.63 mg/L。試驗(yàn)進(jìn)一步觀察了該物質(zhì)對(duì)病原菌菌絲和孢子形態(tài)的影響，結(jié)果表明，經(jīng)特戊酸檸檬酯處理的菌絲和孢子形態(tài)發(fā)生了較為明顯的變化，造成菌絲體斷裂扭曲，原生質(zhì)濃縮，孢子部分畸形。

特戊酸檸檬酯是在前期研究1株辣椒內(nèi)生放線菌代謝抑菌產(chǎn)物中分離合成得到的化合物。馬林等[15]報(bào)道了此株辣椒內(nèi)生放線菌發(fā)酵液對(duì)多種病原真菌有抑制作用。徐光偉等[16]研究報(bào)道，特戊酸檸檬酯是藥對(duì)桂枝-荊芥與其單味藥揮發(fā)油共有的組分，桂枝、荊芥均為中醫(yī)臨床常用解表藥。Liang等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，胡椒精油中的主要化學(xué)成分有特戊酸異檸檬酯，胡椒作為一種香料植物，具有防腐、驅(qū)風(fēng)、抗氧化、抗菌等作用。特戊酸檸檬酯和特戊酸異檸檬酯化學(xué)結(jié)構(gòu)非常接近，都是來源于生物體，與環(huán)境有很好的相容性，不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，因此，具有一定的開發(fā)價(jià)值。本試驗(yàn)只研究了特戊酸檸檬酯對(duì)病原菌的抑制作用及對(duì)菌絲和孢子形態(tài)的影響，對(duì)其作用機(jī)制及其他方面的測(cè)定還有待進(jìn)一步研究。

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