骨髓間充質干細胞輸注對MRL/lpr狼瘡鼠B淋巴細胞CXCR4表達的影響

馬翠， 湯郁， 程孟微， 史偉， 鄭文娟， 裘影影， 芮金兵， 王燕茹

(江蘇大學附屬醫院風濕免疫科， 江蘇 鎮江 212001)

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種臨床表現多樣、發病機制復雜的慢性自身免疫性疾病[1]，B細胞異常活化使人體產生大量自身抗體及免疫復合物是其主要發病機制[2]。相關研究指出CXC趨化因子受體4(CXCR4)與趨化因子CXCL12特異性結合形成CXCL12/CXCR4軸，啟動細胞內信號傳導系統，參與B細胞產生、分化及趨化作用，從而參與SLE的發生發展[3-4]。

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是一種多能、非造血的基質前體細胞，具有顯著的多潛能分化和免疫調節特性[5]，廣泛用于移植治療多種疾病。有多個臨床研究證明異基因BMMSCs治療SLE可獲得較好的療效[6-7]，而關于其改善病情的機制尚待進一步探究。現有的研究表明間充質干細胞輸注可能是通過分泌免疫調節因子和下調輔助性T細胞17(T-helper cell 17，Th17)分化來實現對病情的控制[8]。間充質干細胞改善病情與CXCR4相關的治療機制仍未見報道。本研究檢測BMMSCs輸注后MRL/lpr狼瘡鼠血漿IgG、C3水平，腎臟病理的改善以及狼瘡鼠B細胞、漿細胞表面CXCR4表達的變化，旨在探究BMMSCs輸注改善SLE疾病活動與CXCR4之間的聯系，為控制SLE病情進展提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

MRL/lpr鼠(SPF級)15只， 4～5周齡，雌性，購自上海靈暢生物科技有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2018-0003。C57BL/6 小鼠(SPF級)5只，6 周齡，雌性，購自江蘇大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(蘇)2018-0012。實驗小鼠于江蘇大學動物實驗中心SPF級飼養區飼養至20周齡。

胎牛血清、低糖DMEM 培養液(美國Sigma公司)；B220-PE(骨髓)，CD19-PE(外周血、脾臟)，CD138-APC熒光抗體(美國BD公司)；CXCR4-FITC熒光抗體、驢抗山羊IgG(美國Abcam公司)；流式細胞儀CANTO10C(美國BD公司);IgG、C3 ELISA試劑盒(美國SAB公司)。

1.2 細胞培養

從C57BL/6小鼠的股骨和脛骨中沖洗出骨髓，將全部骨髓細胞置于含有20%胎牛血清的低糖DMEM中，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中進行原代培養。根據全骨髓貼壁篩選法獲取BMMSCs，培養48 h后全量換液，去除沒有貼壁的細胞，之后每3天半量換液1次。待原代細胞生長至匯合度達80%～90%時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。擴增至第3代用于BMMSCs輸注實驗。

1.3 實驗動物分組

實驗動物分為4組，每組5只小鼠，分別為C57BL/6組(C57BL/6鼠未進行尾靜脈輸注)、MRL/lpr組(MRL/lpr鼠未進行尾靜脈輸注)、BMMSCs組(MRL/lpr 鼠于12周齡尾靜脈注射 BMMSCs)、PBS組(MRL/lpr鼠于12周齡尾靜脈注射PBS)；經尾靜脈注射 BMMSCs的濃度為1×106個/mL PBS，按0.01 mL/g體重計算注射劑量，PBS組注射相同體積的PBS，所有動物統一在20周齡末處死。

1.4 ELISA法測定血漿C3和IgG濃度

取小鼠外周血500～1000 μL于EDTA抗凝管，2 500 r/min高速離心5 min，留取上層血漿200～400 μL，按SAB公司配套試劑盒說明書具體操作測定IgG、C3濃度。

1.5 流式細胞儀檢測小鼠外周血、骨髓和脾臟B細胞、漿細胞表面CXCR4表達比例

經各組小鼠眼球內眥的眼眶靜脈叢采集外周血，從股骨和脛骨中分離骨髓，并取脾臟研磨過篩，使用含5%胎牛血清的PBS緩沖液重懸、離心，裂解紅細胞后進行有核細胞計數，每份標本檢測1×106個細胞；在100 μL細胞懸液體系中，對B細胞-CD19/B220、漿細胞-CD138直標熒光單抗4 ℃避光孵育20 min，CXCR4先于4 ℃孵育一抗20 min，洗滌后4 ℃避光孵育FITC熒光二抗20 min，于流式細胞儀檢測。

1.6 HE染色觀察小鼠腎臟組織病理變化

分別將4組小鼠處死后取腎臟，首先經過組織固定、脫水、浸蠟、包埋、切片等處理，再按照購自寶靈科公司的HE染色試劑盒操作說明進行染色，在光學顯微鏡下觀察各組腎臟組織病理變化，最后拍照留存。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 MRL/lpr狼瘡鼠與C57BL/6鼠血漿C3 、IgG濃度及B細胞、漿細胞表面CXCR4表達差異

ELISA 結果顯示，MRL/lpr 組血漿中補體C3濃度較C57BL/6鼠明顯明顯降低(t=4.094，P<0.01)，IgG濃度明顯升高(t=3.997，P<0.01)。 見圖1。流式細胞分析結果顯示，MRL/lpr組外周血CXCR4+CD19+細胞比例較C57BL/6鼠明顯降低(t=5.296，P<0.01)，CXCR4+CD138+細胞比例在兩組間無統計學差異；與C57BL/6鼠相比，MRL/lpr組骨髓CXCR4+B220+細胞比例(t=3.594，P<0.01)和CXCR4+CD138+細胞比例(t=3.486，P<0.05)均明顯升高；MRL/lpr組脾臟CXCR4+CD19+(t=4.021，P<0.01)和CXCR4+CD138+細胞比例(t=4.492，P<0.01)均明顯升高。見圖2。

圖1 ELISA檢測小鼠血漿C3、IgG濃度

圖2 流式細胞術檢測小鼠外周血、骨髓、脾臟B細胞和漿細胞CXCR4表達水平

2.2 BMMSCs輸注對MRL/lpr狼瘡鼠血漿C3、IgG濃度的影響

ELISA結果顯示，3組小鼠血漿C3濃度比較總體差異有統計學意義(F=15.92，P<0.01)，BMMSCs組較PBS組、MRL/lpr組血漿C3濃度明顯升高(P<0.01)；3組小鼠血漿IgG濃度比較總體差異有統計學意義(F=14.40，P<0.01)，BMMSCs組較PBS組、MRL/lpr組血漿IgG濃度均明顯降低(P<0.01)。見圖3。

*：P<0.01，與BMMSCs組比較圖3 輸注BMMSCs后MRL/lpr狼瘡鼠血漿C3、IgG濃度的變化

2.3 BMMSCs輸注對MRL/lpr狼瘡鼠B細胞、漿細胞表面CXCR4水平的影響

3組小鼠B細胞表面的CXCR4表達在外周血(F=7.43，P<0.05)，骨髓(F=14.54，P<0.01)和脾臟(F=12.84，P<0.01)的總體差異均有統計學意義。BMMSCs組較PBS組B細胞表面CXCR4表達在外周血明顯增加(P<0.01)，在骨髓(P<0.01)和脾臟(P<0.05)明顯下降；較MRL/lpr組在骨髓和脾臟表達均明顯下降(P均<0.01)。

3組小鼠漿細胞表面CXCR4表達在骨髓(F=9.34，P<0.05)和脾臟(F=7.25，P<0.05)的總體差異有統計學意義。 BMMSCs組較PBS組、MRL/lpr組漿細胞表面CXCR4表達在骨髓和脾臟比例均明顯降低(P均<0.05)。而3組外周血CXCR4+CD138+細胞比例總體差異無統計學意義(F=1.13，P>0.05)。見圖4。

A：外周血；B：骨髓；C：脾臟。*：P<0.01，#：P<0.05，與BMMSCs組比較

CXCR4+漿細胞比例

2.4 BMMSCs輸注對MRL/lpr狼瘡鼠腎臟組織病理損傷的影響

HE染色結果顯示，C57BL/6組腎臟結構完整，未見明顯炎性細胞浸潤；MRL/lpr組腎臟組織破壞，腎小球、腎小管以及腎間質均出現不同程度損傷，可見腎小球系膜增生、白細胞浸潤，腎小管出現腫脹、萎縮等改變，間質局部少量纖維組織增生以及大量炎癥細胞浸潤。與PBS組、MRL/lpr組相比，BMMSCs組腎臟中腎小球系膜增生減輕，腎間質內炎性細胞浸潤明顯減少，腎小管腫脹程度減輕，總體上腎臟的病理損傷程度明顯改善。見圖5。

箭頭示大量炎性細胞浸潤的腎小球及腎間質圖5 小鼠腎臟組織HE染色結果(×200)

3 討論

SLE是典型的慢性、全身性自身免疫疾病，研究表明SLE患者血漿C3和IgG水平高低及其變化程度與病情嚴重程度和變化密切相關[9]。MRL/lpr狼瘡模型鼠含有Fas基因隱性突變，與人類紅斑狼瘡相似，包括顯著的血清自身抗體、免疫復合物腎小球腎炎、血管炎等[10]，是較好的代表SLE的動物模型。本實驗觀察到MRL/lpr狼瘡鼠血漿IgG濃度明顯高于正常對照組C57BL/6小鼠，C3較C57BL/6小鼠呈現顯著低水平，狼瘡鼠腎臟HE染色表現為腎小球、腎小管及腎間質的多重損傷。這與SLE患者血漿IgG、補體C3較健康者的表達水平趨勢一致，也與狼瘡性腎炎患者的腎臟病理表現相近。

SLE臨床治療主要是以糖皮質激素及免疫抑制劑為主，盡管在治療策略和后期護理已有改進，但該疾病仍呈現易復發的特點，甚至仍有部分患者因持續的免疫抑制治療及藥物不良反應累積死于嚴重的出血及感染[11]。BMMSCs輸注作為新的治療手段已在臨床實行，因其低免疫原性、無免疫排斥的特點，已有多個臨床試驗證明BMMSCs輸注能夠安全有效地改善SLE患者的病情，且自體移植和異體移植都易成功[6-7，12]。本實驗發現BMMSCs組較PBS組和MRL/lpr組小鼠血漿IgG水平降低，C3水平升高，且HE染色提示輸注BMMSCs后腎臟病理明顯改善。證明BMMSCs 輸注可以有效控制狼瘡鼠病情活動。

BMMSCs 輸注改善SLE病情的機制目前認為主要為以下幾點：① 抑制包括T細胞、B細胞、自然殺傷細胞等多種免疫細胞的增殖與活化，影響免疫因子分泌[7]；② 調節轉化生長因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)的表達從而下調Th17水平以發揮療效[8]；③ 通過可溶性細胞因子影響B淋巴細胞表面趨化因子的表達[7]。近年來研究顯示，狼瘡患者的骨髓微環境存在一定缺陷，包括BMMSCs結構異常及功能減退[13]、B細胞分化及遷移異常[4]、抗體分泌相關細胞因子表達紊亂[14]等。本研究顯示MRL/lpr 狼瘡鼠外周血B細胞CXCR4表達水平低下，在骨髓表達水平升高。我們的前期研究發現SLE患者骨髓上清分泌更高水平的趨化因子CXCL12，提示狼瘡骨髓微環境存在多方面的缺陷。CXCR4作為CXCL12的受體，二者相互作用參與了SLE患者 B細胞活化、漿細胞的產生以及自身抗體的分泌[15]，由此推測狼瘡病情活動時骨髓內環境可能分泌大量CXCL12，導致CXCR4+B細胞向骨髓遷移，因此在外周血中呈低水平。同時本研究中狼瘡鼠骨髓CXCR4+CD138+比例高于C57BL/6小鼠，這與Hanaoka等[4]、Ma等[16]研究中漿細胞表面CXCR4的表達結果相一致。漿細胞是B細胞活化的結果，有研究顯示骨髓漿細胞可能是狼瘡耐藥或者復發的原因之一[17]，骨髓CXCR4+CD138+細胞比例增高對SLE的意義有待深入研究。

有學者證實脾臟CXCL12、CD54及IL-6等聯合作用影響B細胞的遷移，并將漿細胞吸引至脾臟，促其保留和發揮功能[18]。Wang等[19]證實病情活動期小鼠脾臟高表達CXCL12。本研究中MRL/lpr狼瘡鼠脾臟CXCR4+CD19+細胞、CXCR4+CD138+細胞比例較C57BL/6小鼠均明顯升高，再次證明了CXCR4-CXCL12相互作用參與狼瘡鼠疾病活動。

本研究進一步比較了MRL/lpr狼瘡鼠輸注BMMSCs后外周血、骨髓及脾臟中CXCR4+B細胞、CXCR4+漿細胞比例的差異，結果顯示，輸注BMMSCs后CXCR4+B細胞比例在外周血表達增高，在骨髓、脾臟中明顯下降；同時，輸注BMMSCs可顯著降低骨髓、脾臟中CXCR4+漿細胞比例。因此，我們推測BMMSCs輸注可能通過糾正MRL/lpr狼瘡鼠B細胞、漿細胞表面CXCR4的異常表達，減少自身抗體分泌、降低IgG水平以及增加C3等免疫復合物的產生，從而改善腎臟損傷，減緩病情的進展。

綜上所述，本研究結果表明狼瘡鼠CXCR4+B細胞、CXCR4+漿細胞在外周血、骨髓及脾臟中分布異常，同種異體BMMSCs輸注可糾正其分布。本研究對BMMSCs輸注治療改善狼瘡疾病活動與CXCR4相關機制進行了探索，為SLE患者的治療提供了新思路。