全蝎和蜈蚣的多肽粗提物對肝癌細胞中HBV的抑制作用

馬青，楊揚，馬韜，徐衛東，趙明

(1. 江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013； 2. 上海計劃生育科學研究所，上海 200032； 3. 上海交通大學附屬瑞金醫院普外科，上海 200025)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染可誘發肝癌，導致全球每年超過100萬人死亡[1]。HBV閉合環狀DNA合成下一代病毒RNA[2]，前基因組RNA編碼HBV聚合酶和HBV核心蛋白(HBV core protein, HBc)[3]，病毒逆轉錄酶合成HBV基因組的負鏈[4]。HBV基因組編碼4個開放閱讀區：P、C、S、X，其中P基因編碼病毒聚合酶，C基因編碼核衣殼的結構蛋白以及HBV核心抗原(HBeAg)，S基因編碼3種不同的包膜糖蛋白，包括HBV表面抗原(HBsAg)，而X基因編碼多功能X蛋白[1]。HBV主要治療藥物是核苷酸類似物，如拉米夫定和恩替卡韋，其中，拉米夫定主要通過抑制病毒逆轉錄酶活性抑制HBV產生[5-6]，而恩替卡韋對HBV聚合酶具有很高的選擇性，長期服用可能造成患者肝損傷。全蝎(ButhusmartensiiKarsch)及蜈蚣(ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch)作為廣譜性抗病毒中藥材，從中提取的某些毒性肽具有抗病毒作用[7-9]。以往研究表明，全蝎和蜈蚣的活性多肽的分子量分別集中在5～10 kDa和5 kDa以下兩個主要區域[10-12]。肝癌HepAD38細胞在誘導型四環素啟動子的控制下可以產生HBV，當去除細胞培養液中四環素后，可誘導HBV RNA轉錄和蛋白質合成。目前，全蝎和蜈蚣的多肽是否具有抗HBV活性尚不清楚。因此，本研究擬通過對全蝎尾部提取的5～10 kDa多肽(PEST)和蜈蚣頭部提取的5 kDa以下多肽(PECH)2個組分與HepAD38細胞體外共培養，行抗HBV活性研究。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑及儀器

全蝎和蜈蚣購自江蘇大學附屬醫院，由江蘇大學醫學院趙明主任中藥師完成樣本鑒定。肝癌HepAD38細胞、HepG2細胞均由上海計劃生育科學研究所分子實驗室贈予。

DMEM、Trizol(美國Thermo Fisher公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；100×青霉素/鏈霉素溶液(上海源培生物科技股份有限公司)；四環素(睿鉑賽生物科技有限公司)；MTT(上海生工生物工程有限公司)；微型分光光度計ASP-3700(美國ACTGene公司)；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；PBST(澳大利亞Devondale公司)；PVDF膜、GAPDH(美國Abcam Biotechnology公司)；鼠抗HBc，兔抗GAPDH，山羊抗兔或抗鼠IgG(美國Cell Signaling 公司)；化學發光試劑(北京Key-Bio公司)；RT-6500酶標儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司)；HBV核酸擴增(PCR)熒光定量試劑盒(中美生物技術公司)；HBsAg診斷試劑盒(萬泰生物藥業股份有限公司)；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(德國天根生化科技公司)；Light Cycle 480Ⅱ實時熒光定量PCR系統(美國Roche公司)；Tanon-5200化學發光成像系統(上海天能科技有限公司)；二甲基亞砜、拉米夫定、恩替卡韋均購自美國Sigma-Aldrich公司；其余生化試劑均為國產分析純。

1.2 細胞培養

HepAD38細胞培養于含DMEM、10%胎牛血清、100×青霉素/鏈霉素溶液和6.86 μmol/L四環素的培養基中。HepG2細胞培養在無四環素的相同培養基中。培養條件為溫度37 ℃，含5% CO2。

1.3 多肽提取物制備及濃度與重金屬測定

取全蝎尾部與蜈蚣頭部，用0.5 mL PBS清洗3次；加入0.2×PBS于4 ℃勻漿；4 ℃，2 000×g離心30 min、離心2次收集上清液；5 000×g，4 ℃超濾10 min；加入200 μL PBS重復超濾3次；分別收集全蝎5～10 kDa超濾液，蜈蚣5 kDa以下超濾液；于-80 ℃保存2 h；用冷凍干燥器濃縮至1/5；濃縮液以4 ℃、2 000 ×g離心20 min，收集上清液；全蝎和蜈蚣的多肽提取物分別命名為PEST和PECH。多肽濃度直接通過微型分光光度計測量，取部分送由中國科學院南京土壤研究所測定重金屬含量。剩余于-80 ℃保存。

1.4 細胞活力與HBV DNA含量檢測

1.4.1 細胞分組和處理 HepAD38細胞常規培養48 h。細胞分組如下：對照組采用空白培養基培養；PEST組：分別用0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL PEST處理；PECH組：分別用0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL PECH處理；陽性對照組：0.250 μmol/L拉米夫定或0.010 μmol/L恩替卡韋或6.860 μmol/L四環素；培養48 h。更換含上述藥物培養基或空白培養基，再培養72 h，收集上清液保存于-80 ℃用于HBV DNA測定，其余用于細胞活力測定。HepG2細胞常規培養12 h，細胞分組如下：對照組采用空白培養基培養；PEST組：分別用0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL PEST處理；PECH組：分別用0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL PECH處理；分別培養24、48、72 h，用于細胞活力測定。篩選PEST和PECH活性濃度范圍。

1.4.2 MTT法檢測細胞活力 培養板中每孔加入90 μL培養基和10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，孵育4 h；加入150 μL DMSO，振蕩10 min以溶解結晶；用酶標儀檢測570 nm處光密度(D)值。細胞活力(%)=(實驗組D值-調零孔D值)/對照組D值-調零孔D值)×100%。

1.4.3 qRT-PCR檢測HBV DNA含量 從HepAD38細胞上清液中提取HBV DNA；qRT-PCR檢測：18.8 μL HBV PCR反應液+0.2 μLTaq酶+0.03 μL尿嘧啶-N-糖基化酶，混合均勻后取19 μL分裝入PCR管，加入1 μL待測樣本DNA，共20 μL總反應體系；37 ℃反應5 min，95 ℃變性3 min，接著95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，50個循環。羧基熒光素檢測通道(FAM)收集信號，60 ℃收集數據。HBV DNA拷貝數用不同濃度HBV標準品制成的標準曲線進行定量。

1.5 HBV抗原含量、mRNA相對表達以及HBc含量檢測

1.5.1 細胞分組和處理 HepAD38細胞常規培養48 h。對照組采用空白培養基培養；PEST組和PECH組分別用1 mg/mL PEST、PECH處理；陽性對照組：0.250 μmol/L拉米夫定或0.010 μmol/L恩替卡韋或6.860 μmol/L四環素；培養48 h；更換相應培養基再培養72 h。取上清液檢測HBsAg和HBeAg含量，細胞用于qRT-PCR檢測X/S/preC/PmRNA相對表達和HBc表達。

1.5.2 ELISA法檢測HBsAg和HBeAg含量 檢測HBsAg時， 每組設3個復孔，標準品孔中加入標準品溶液各50 μL，樣本孔中加入樣本溶液各10 μL和稀釋液40 μL，再加入100 μL檢測抗體，封閉，于37 ℃孵育60 min；檢測HBeAg時，樣品孔和陰性對照設3個復孔，陽性對照設2個復孔，相應孔中加入待測溶液各50 μL和酶標試劑50 μL，封閉，于37 ℃孵育30 min。兩種微孔板均洗滌5次，毎孔加入A液、B液各50 μL，于37 ℃孵育15 min，加終止液50 μL，立即用酶標儀以雙波長450 nm/600～650 nm進行檢測。具體操作步驟按說明書進行。計算HBsAg和HBeAg的相對含量：相對含量(%)=(實驗組D值-調零孔D值)/對照組D值-調零孔D值)×100%。

1.5.3 qRT-PCR檢測X、S、preC、P等mRNA相對表達 采用Trizol法提取細胞總RNA，進行逆轉錄，反應體系共20 μL，RNA 2 μL，5×gDNA緩沖液2 μL ,快速逆轉錄緩沖液2 μL，逆轉錄酶混合物1 μL，FQ-逆轉錄隨機引物2 μL，無RNA酶的雙蒸水11 μL，操作方法參照逆轉錄試劑盒說明書進行。qRT-PCR反應體系共20 μL：羅氏緩沖液10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物各2 μL，加無菌水至20 μL。qRT-PCR引物序列：X基因上游為5′-TGCGCAGACCAATTTATGC-3′，下游為5′-CTCAGCAATGTCAACGACC-3′；S基因上游為5′-GGTAGGAGCTGGAGCATTCG-3′，下游為5′-GTAGGCTGCCTTCTTGACTG-3′；preC基因上游為5′-GGAGCTACTGTGGAGTTACTCTC-3′，下游為5′-TGTTCAAG CCTCCAAGCTGT-3′；P基因上游為5′-TTGTGG GTCTTTTGGGTTTTG-3′，下游為5′-GTTGGCGAG AAAGTGAAAGC-3′；GAPDH基因上游為5′-CAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，下游為5′-AGGTGGAGGAGTGGGTG-3′。反應程序：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，40 ℃ 10 s，共35個循環。樣本mRNA Ct值通過GAPDH的Ct值均一化，即ΔCt=Ct樣本-Ct內參，樣本基因mRNA相對豐度值以2-ΔΔCt值表示。

1.5.4 蛋白印跡法檢測HBc表達 取“1.5.1”細胞，加入上樣緩沖液于100 ℃煮10 min，冰上冷卻2 min；10 000 r/min、4 ℃離心2 min；行SDS-PAGE，90 V 1 h；200 mA 2 h轉印至PVDF膜；用含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉1 h；放入一抗稀釋液(小鼠HBc抗體，1 ∶1 000)，內參稀釋液(兔GAPDH，1 ∶2000)，室溫孵育1 h；PBST洗膜4次，每次10 min；加入二抗(抗小鼠IgG 1 ∶10 000，或抗兔IgG 1 ∶3 000)孵育1 h；PBST洗膜4次，每次10 min；ECL化學發光試劑盒顯色，通過灰度掃描分析各蛋白表達量。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 提取物多肽濃度與重金屬含量測定

PEST多肽濃度為6.000 mg/mL，PECH多肽濃度為5.600 mg/mL。重金屬檢測結果表明，PEST、PECH以及細胞培養基中的重金屬含量均在機器檢測誤差范圍內，因此重金屬含量對細胞造成的影響可以忽略。見表1。

表1 各樣本的重金屬含量 mg/mL

2.2 PEST和PECH對HepAD38和HepG2細胞無毒性

由圖1可見，肝癌HepAD38和HepG2細胞活力在70%以上，各組之間未見顯著性差異，表明PEST和PECH對其沒有細胞毒性。在HepG2細胞中，48 h時，與對照組相比，0.250和0.500 mg/mL PEST組細胞活力顯著升高(t=3.26，3.31，P<0.05)，0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL PECH組細胞活力顯著升高(P均<0.05)，與0.125 mg/mL組相比，0.250和0.500 mg/mL PEST組細胞活力顯著升高(t=4.67，3.35，P<0.05)；72 h時，與對照組相比，0.250、0.500和1.000 mg/mL PEST組細胞活力顯著升高(P均<0.05)，1.000 mg/mL PECH組細胞活力顯著升高(t=2.25，P<0.05)，與0.125 mg/mL組相比，0.250、0.500和1.000 mg/mL PEST組細胞活力顯著升高(P均<0.05)，1.000 mg/mL PECH組細胞活力顯著升高(t=4.21，P<0.05)。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與同時間點0.125 mg/mL比較圖1 PEST和PECH分別對HepAD38和HepG2細胞活力的影響

2.3 PEST和PECH抑制HBV DNA復制

與對照組相比，0.250、0.500和1.000 mg/mL PEST組和0.125、0.500、1.000 mg/mL PECH組HBV DNA拷貝數顯著降低(P<0.05或<0.01)。由此可見，特定濃度的PEST和PECH可抑制HBV DNA復制，其中1.000 mg/mL濃度作用下HBV DNA拷貝數最小，故選此濃度進行后續抗HBV活性實驗。同時，四環素、恩替卡韋和拉米夫定組HBV DNA拷貝數較對照組顯著降低(P均<0.01)。見圖2。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較圖2 不同組HBV DNA拷貝數比較

2.4 PEST和PECH抑制HBsAg和HBeAg含量

與對照組相比，PEST組和PECH組HBsAg含量和HBeAg含量均顯著降低(P<0.05或<0.01)。由此可見，PEST和PECH可抑制HBV抗原分泌。同時，四環素、恩替卡韋和拉米夫定組HBsAg含量和HBeAg含量較對照組顯著降低(P<0.05或<0.01)。見圖3。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較圖3 不同組HBsAg和HBeAg含量比較

2.5 PEST和PECH降低HBV P mRNA相對表達

與對照組相比，PEST組和PECH組XmRNA相對表達顯著升高(t=11.86，P<0.01；t=4.75，P<0.05)；PEST組和PECH組S和preCmRNA相對表達無明顯變化。PEST組和PECH組PmRNA相對表達顯著降低(t=6.79，5.12，P均<0.05)；同時，四環素組X、preC和PmRNA，恩替卡韋組和拉米夫定組PmRNA相對表達顯著降低(P均<0.05)，拉米夫定組SmRNA相對表達顯著升高(P<0.05)。見圖4。

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較圖4 不同組HBV X/S/preC/P mRNA相對表達量比較

2.6 PECH抑制HBc合成

與對照組相比，四環素組、拉米夫定組和PECH組HBc表達量顯著降低(P<0.05或<0.01)，恩替卡韋組HBc表達量顯著升高(t=22.17，P<0.01)，而PEST組HBc表達量無顯著性差異。由此可見PEST對HBc合成幾乎無影響，而PECH能抑制其合成。見圖5。

M：蛋白分子標準參照物；a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較圖5 不同組HBV core蛋白表達量比較

3 討論

全蝎和蜈蚣的毒液是獨特的藥理資源，其中包含大量具有高度靶向功能的蛋白質和多肽類成分[13]。然而，獲取毒液困難且花費高昂，本研究采用的提取多肽方法相對簡單且經濟。

抗HBV藥物也用于與HBV相關的肝細胞癌患者的輔助治療，顯著降低患者體內病毒載量及活躍度，從而延緩病程的進展和復發[14]。HepAD38屬于可以分泌HBV的肝癌細胞，HepG2屬于肝癌細胞，因此抗HBV作用也可以以細胞毒性的形式表達。PEST和PECH樣本中重金屬含量在正常范圍，本研究分別設置0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL濃度梯度的PEST組和PECH組以探索細胞毒性，結果顯示二者對HepAD38和HepG2無細胞毒性。據報道，蜈蚣毒素肽在低濃度下可作為細胞生長因子[15]，據此可以推測PECH類似細胞生長因子在低濃度下促進HepG2細胞生長。同樣在HepAD38細胞中探索0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL濃度梯度的PEST組和PECH組對HBV DNA拷貝數的影響。預實驗表明，去除四環素后第5天HBV DNA拷貝數約為去除四環素后第2天的53倍，與其他研究一致[16]。由此表明，PEST和PECH可以抑制HBV DNA復制，其中1.000 mg/mL抑制效果最好。

抑制HBV復制必然減少HBsAg和HBeAg的分泌[17]，本研究結果證實PEST和PECH顯著抑制HBsAg和HBeAg分泌。此外，PEST和PECH使HBVPmRNA相對表達量顯著降低。需要進一步驗證P蛋白表達顯著降低是否只是由于HBV的PmRNA特異性編碼HBV聚合酶[1,18]，沒有直接的結構信息可用于P蛋白，但是P蛋白是從pgRNA翻譯而來的，pgRNA也可以作為HBc的mRNA，故進一步分析HBc表達，結果表明PECH能抑制HBc表達。

由于多肽類成分分離的復雜性，PEST和PECH樣本中多肽成分的分離純化有待進一步研究。如果分離出有效單體化合物，將更好地發揮全蝎和蜈蚣的抗HBV價值。目前關于PEST和PECH抗HBV活性的研究僅限于HepAD38細胞，還有待于使用動物模型進一步探索。

綜上所述，PEST和PECH具有良好的抗HBV活性，可以抑制HBV DNA復制、抑制HBsAg和HBeAg分泌，PECH可以抑制HBc合成。PEST和PECH在HepAD38細胞株中表現出抗HBV作用，可能與PEST、PECH抑制HBVPmRNA合成有關。