LncRNA44372在卵巢癌中的差異表達及生物信息學分析

丁璟, 楊鑫鑫, 鄒雪琴， 高淑君， 劉雪， 潘玲麗，張鰍丹， 趙楊靜， 梁秀婷，王薈， 朱彥玲， 邵啟祥

(1. 江蘇大學醫學院， 江蘇 鎮江 212013； 2. 江蘇大學附屬徐州醫院婦產科， 江蘇 徐州 221005)

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度大于200 nt的RNA轉錄物，具有很少的蛋白編碼功能[1]。研究表明，lncRNA與多種生理和病理過程有關，尤其是癌癥的發生發展，其異常表達可致癌細胞不受細胞周期調控，無限增殖[2]。lncRNA可從基因的轉錄前、轉錄和轉錄后水平進行調控，還調控DNA甲基化，重構染色質和組蛋白甲基化、乙酰化等表觀遺傳[3]。lncRNA常見的作用機制是通過海綿體吸附某些miRNA從而影響下游靶mRNA，構成競爭性內源RNA網絡，從而調控基因的表達和功能的發揮[4]。但是，lncRNA在卵巢癌中發揮的生物學作用尚不清楚。本研究通過GEO數據庫篩選獲得在卵巢癌中具有顯著差異表達的lncRNA44372，其位于chr6:165773201-165773271。進一步采用生物信息學技術對其生物學作用進行預測分析，并運用定量PCR驗證其在卵巢癌細胞中的表達水平。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑與儀器

人卵巢癌細胞系HO8910，3AO，A2780，OVCR3以及卵巢上皮HOSEpiC細胞由江蘇大學醫學院周小明教授惠贈；人卵巢癌SKOV3細胞由江蘇大學醫學院盧小東教授惠贈。

DMEM，RPMI 1640，胎牛血清購于美國Gibco公司；Trizol 試劑購于寶日醫生物技術(北京)有限公司；異丙醇、氯仿、無水乙醇購自上海國藥集團化學試劑有限公司；逆轉錄試劑盒、PCR ExTaqDNA聚合酶和SYBR?Premix ExTaqTMⅡ購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；焦炭酸二乙酯(DEPC)水購于上海生工生物工程有限公司；實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；NanoDrop1000測定儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 下載數據庫 從NCBI GEO(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數據庫中下載基因芯片數據集。進入NCBI網站，找到“GEO DataSets”搜索關鍵詞“ovarian tissue samples”，“normal”，“tumor”，點擊“search”，下載基因表達譜芯片數據GSE119054。它的基因芯片平臺是GPL19615 Agilent-067406 CBC lncRNA + mRNA microarray V4.0。

1.2.2 篩選在卵巢癌中差異表達的lncRNA 在腫瘤轉錄組數據庫CRN(http:∥syslab4.nchu.edu.tw/index.jsp)中對來自NCBI GEO數據庫中卵巢癌及正常組織樣本數據分析，以P<0.05，差異倍數1.2倍以上為條件，篩選出在卵巢癌中表達上調和下調的lncRNA。

1.2.3 篩選與lncRNA44372作用的相關基因 通過在線工具Annolnc(http:∥annolnc.cbi.pku.edu.cn/)[5]篩選出可能與lncRNA44372表達水平相關的基因，并用互作分數來表示共表達的強度。

1.2.4 lncRNA44372的GO分析和信號通路分析 利用在線工具David[6-7](https:∥david.ncifcrf.gov)對篩選出的共表達基因進行基因本體論分析(gene ontology，GO)及信號通路分析。

1.2.5 lncRNA44372的競爭性內源RNA網絡構建 通過在線工具starbase(http:∥starbase.sysu.edu.cn/)研究lncRNA44372可靶向的miRNA分子和下游靶mRNA分子。利用在線數據庫GEPIA(http:∥gepia.cancer-pku.cn)研究靶mRNA分子在卵巢癌中的表達量。

1.2.6 細胞培養 將卵巢癌SKOV3，HO8910，OVCR3和3AO細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養，卵巢上皮細胞癌A2780細胞和卵巢上皮HOSEpiC細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養。

1.2.7 RNA提取 取對數生長期的“1.2.6”細胞，以1×105密度接種于6孔板中，待細胞長至匯合度80%時取出；棄去培養基，用預冷PBS洗滌2次；每孔加入1 mL Trizol 試劑，在冰上靜置5 min；用微量移液器小心吹打細胞使其脫落并轉移至1.5 mL EP管中，加入200 μL氯仿，上下顛倒混勻5次，靜置5 min；于4 ℃ 12 000×g離心15 min；取上清液，加入500 μL異丙醇，上下顛倒混勻5次后靜置5 min；于4 ℃ 12 000×g離心10 min；棄上清液，每管加入75%乙醇1 mL漂洗沉淀；于4 ℃ 7 500×g離心5 min；棄去上清液后室溫干燥，每管加入適量DEPC水溶解RNA，用NanoDrop ND-1000測定RNA濃度和純度。

1.2.8 逆轉錄反應 根據逆轉錄試劑盒說明書將提取的總RNA逆轉錄成cDNA。反應條件：37 ℃反應15 min， 85 ℃反應5 min，4 ℃得到cDNA，保存于-20 ℃備用。

1.2.9 實時熒光定量PCR檢測lncRNA44372表達 引物設計采用Primer 5.0軟件，β-肌動蛋白上游引物序列為5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物序列為5′-ATACTCCTGCTTGCTGATC-3′；lncRNA44372上游引物序列為5′-TATTGCACTTGGACGGAGCA-3′，下游引物序列為5′-AAGGCAAGCAACTTGACACG-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以cDNA 0.5 μL為模板，上下游引物各0.2 μL，SYBR Premix ExTaqTMⅡ5.0 μL，滅菌水4.1 μL，配制10 μL反應體系。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。每個樣本設置3個復孔，根據熔解曲線形態判斷反應的特異性，通過2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 卵巢癌中差異表達的lncRNA

在腫瘤轉錄組數據網站CRN中對來自NCBI GEO數據庫中有關的卵巢癌樣本結果分析，其中根據表達量差異及P值發現，與卵巢正常組織相比，卵巢癌組織中表達上調的lncRNA有CROCCP2，lncRNA 00883，lncRNA00704，MCM3AP-AS1，DLEU2，NBLA00301；表達下調的lncRNA有lncRNA44372，lncRNA00657，RP11-890B15.3，TP73-AS1，差異具有統計學意義(P<0.05)。本實驗室前期芯片檢測結果[7]發現，在卵巢癌細胞系中有227個lncRNA表達上調，有483個lncRNA表達下調；結合基因表達譜芯片數據GSE119054選擇lncRNA44372作為研究對象。

2.2 與lncRNA44372作用相關的共表達基因的篩選結果

根據相關作用分數及P值<0.05，篩選出與lncRNA44372存在相互作用關系的基因有579個。根據相關作用分數對579個基因進行排序，篩選出最具有相關性的10個基因(表1)。這些基因的功能主要涉及蛋白激酶活性、細胞凋亡、細胞周期等。

表1 相關性顯著的10個基因

2.3 與lncRNA44372共表達基因的GO分析

對579個相關基因和lncRNA44372進行GO分析(表2)。結果顯示，共表達基因在生物過程中富集在細胞周期調控、細胞轉運、細胞骨架調控、細胞遷移、蛋白肽調節等方面；分子功能主要富集在信號傳感器活性的調節、MHCⅡ類受體分子的活性、GTP酶激活劑活性、蛋白蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白結合能力等方面。見圖1。

表2 相關基因的GO分析

圖1 相關基因的GO分析

2.4 與lncRNA44372共表達基因的信號通路分析

信號通路富集分析表明，lncRNA44372可以在腫瘤壞死因子受體及其介導的細胞凋亡途徑、p75神經營養因子受體介導的細胞凋亡通路，神經生長因子及其受體酪氨酸激酶A介導的腫瘤發生、增殖、血管生成和轉移等相關途徑發揮作用。

2.5 lncRNA44372的競爭性內源RNA網絡構建

生物信息學在線工具starbase分析發現lncRNA44372可靶向的miRNA分子有miR-190和miR-193，相關的下游靶mRNA分子有UBLCP1、PHF20L1、ULK2、MED15、DPY19L1、PYROXD1和LONP2等(圖2 A)。通過GEPIA數據庫預測靶mRNA分子在卵巢癌中的表達，結果顯示與正常樣本相比，ULK2分子(t=2.43，P<0.05)和LONP2分子(t=2.49，P<0.05)在卵巢癌中表達明顯降低(圖2B)。

2.6 lncRNA44372在卵巢癌細胞的表達

qRT-PCR檢測結果顯示，與卵巢正常HOSEpiC細胞相比，lncRNA44372在卵巢癌細胞A2780(t=13.18，P<0.01)，SKOV3(t=12.82，P<0.01)，HO8910(t=5.36，P<0.05)，OVCR3(t=5.19，P<0.05)，3AO(t=4.73，P<0.05)中表達明顯下調，且與生物信息學結果一致。見圖3。

A:競爭性內源RNA網絡構建; B: ULK2和LONP2在卵巢癌組織及正常組織中的表達圖2 競爭性內源RNA網絡及靶mRNA在卵巢癌組織和正常組織中的表達

a：P<0.05，b: P<0.01，與HOSEpiC細胞比較圖3 lncRNA44372在卵巢癌細胞系和卵巢正常細胞中的表達

3 討論

本研究首先通過NCBI GEO數據庫篩選出在卵巢癌中表達具有差異意義的lncRNA44372，并進一步分析與其相關的基因。GO分析和信號通路分析結果顯示，lncRNA44372可能與調控細胞遷移、侵襲變化，細胞周期改變，細胞骨架蛋白調控，蛋白蘇氨酸/酪氨酸激酶活性的調節等有關。

研究表明，細胞遷移和侵襲變化可促進腫瘤細胞的上皮間質轉化過程[8]，促進腫瘤轉移；細胞周期失控可以使得腫瘤細胞不接受抑制信號，持續增殖[9]；細胞骨架蛋白Rho經GDP激活后，可以與下游分子結合使得細胞骨架重排。有文獻指出，lncRNA PCGEM1可以通過上調RhoA表達促進卵巢癌的發展[10]。此外，蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶活性對腫瘤細胞的遷移具有調控作用。例如，lncRNA-BANCRY通過激活蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶，從而通過調節細胞自噬來抑制甲狀腺癌細胞增殖[11]。但是，lncRNA44372在上述生物學過程中發揮的作用尚需進一步研究。

通過生物信息學預測，lncRNA44372可能與miR-190，miR-193及下游UBLCP1、PHF20L1、ULK2、MED15、DPY19L1、PYROXD1和LONP2的靶mRNA分子構成競爭性內源RNA網絡。在該網絡中，與正常組織相比，lncRNA44372呈低表達且像海綿體一樣吸附靶miRNA分子，而被吸附的miRNA分子可負向調控靶mRNA分子。因此，只有在卵巢癌中下調表達的mRNA分子才可能發揮作用。

研究發現，ULK2分子在卵巢癌中呈低表達，其主要作用是編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶，并且可以調節細胞代謝和自噬途徑[12]，該發現與本研究中GO分析結果相一致。此外，LONP2分子同樣在卵巢癌中呈低表達。有研究發現，LONP2 在宮頸癌中通過氧化應激促進子宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲[13]。因此推斷，lncRNA44372可能與miR-190，miR-193及ULK2和LONP2構成競爭性內源RNA網絡。此外，在細胞水平證實lncRNA44372在卵巢癌中呈低表達，與生物信息學預測結果一致。

綜上所述，lncRNA44372在卵巢癌組織中呈低表達，可能通過影響卵巢癌細胞凋亡、細胞周期和細胞蛋白激酶活性等促進卵巢癌發展。