食管癌細胞來源的外泌體促進人臍靜脈血管內皮細胞血管生成

施晉升, 王茂松, 李本忠, 張秀梅

(南京醫科大學康達學院附屬興化醫院心胸外科, 江蘇 興化 225700)

食管癌是我國最常見的消化系統腫瘤之一，其發病率居惡性腫瘤的第5位，死亡率居第4位。我國2018年食管癌新發患者和死亡患者分別為25.8萬和18.5萬，均占全球的55%左右[1-2]。食管癌的術后復發以及癌細胞的轉移是導致食管癌患者死亡的重要因素之一，而腫瘤血管形成與腫瘤的侵襲、浸潤和轉移密切相關，直接影響腫瘤患者的預后[3]。研究表明腫瘤細胞可產生血管形成因子，促進血管內皮細胞增殖，刺激毛細血管生長[4]。然而，腫瘤組織中調控血管內皮細胞血管形成過程的具體機制尚不清楚[5]。外泌體是直徑為30～150 nm的細胞外囊泡，含有核酸、蛋白質等多種生物大分子，作為細胞間信息交流的重要載體[6]，其在組織損傷和腫瘤發生發展、復發轉移的各個過程中發揮重要作用[7-12]。本研究擬觀察食管癌細胞EC109分泌的外泌體(EC109-ex)促進人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)血管形成的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

食管癌細胞株EC109和 HUVECs購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；H-DMEM、胎牛血清、胰酶(美國Gibco公司)；小鼠抗人CD9抗體、CD63抗體(德國Millipore公司)，小鼠抗人CD31抗體、兔抗人CD34抗體、兔抗人VEGF抗體(美國Abcam公司)；兔抗人β-肌動蛋白抗體、HRP標記山羊抗兔/小鼠IgG二抗(北京康為世紀生物科技有限公司)；CM-DiR染料(美國Invitrogen公司); hoechest33342染料(美國Sigma公司)；外泌體快速提取試劑(美國SBI公司)；BCA蛋白提取和濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；Transwell小室(美國Corning公司); Matrigel基質膠(美國BD公司)；PVDF膜、100 kDa MWCO超濾離心管(德國Millipore公司)；CO2培養箱(美國Forma公司)；ImageQuant LAS4000mini化學發光成像分析系統(美國GE公司); HT7800透射電鏡(日本HITACHI公司); TE300倒置式生物顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 細胞培養

EC109和HUVECs細胞采用含10 %胎牛血清的H-DMEM，置于37 ℃、5% CO2培養。

1.3 EC109-ex提取

收集處于對數生長期的EC109細胞上清液，采用梯度-超速離心法提取EC109-ex。4 ℃、10 000×g離心30 min去除細胞碎片，上清液用100 kDa MWCO超濾管過濾；4 ℃、1 000×g離心30 min獲得含EC109-ex的濃縮液；加入外泌體快速提取試劑，4 ℃沉淀過夜；4 ℃、1 500×g離心30 min，收集沉淀，PBS洗滌后重懸于PBS，分裝后-80 ℃凍存備用。

1.4 透射電鏡觀察EC109-ex結構

取50 μL EC109-ex滴于載樣銅網，室溫靜置2 min，滴加1%磷鎢酸溶液(pH=6.8)復染5 min，室溫風干后透射電鏡下觀察EC109-ex形態。

1.5 蛋白質印跡法檢測外泌體和血管形成標志蛋白表達

1.5.1 EC109-ex外泌體表面標志CD9、CD63檢測 取EC109-ex樣品，加入RIPA/PMSF/PIC蛋白裂解液，冰上搖床混勻10 min，超聲法裂解4次；4 ℃、15 000×g離心15 min，收集上清液獲得蛋白。BCA法檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液，煮沸10 min。取蛋白樣品50 μg進行10% SDS-PAGE，小鼠抗人CD9抗體(1 ∶500)、小鼠抗人CD63抗體(1 ∶500)、兔抗人β-肌動蛋白抗體(1 ∶2 000)4 ℃孵育過夜；TBS/T洗滌，加入HRP標記的山羊抗兔/小鼠IgG(1 ∶3 000)，37 ℃孵育1 h；TBS/T洗滌，超敏ECL發光法顯色，經化學發光成像分析系統曝光并分析結果。

1.5.2 HUVECs血管標志蛋白檢測 HUVECs經5 μg/mL和10 μg/mL EC109-ex處理48 h后，提取總蛋白，變性處理后，取蛋白樣品20 μg，經電泳、轉膜、洗滌封閉，分別結合小鼠抗人CD31抗體(1 ∶1 000)、兔抗人CD34抗體(1 ∶1 000)、兔抗人β-肌動蛋白抗體(1 ∶2 000)、兔抗人VEGF抗體(1 ∶500)，4 ℃孵育過夜，洗滌，山羊抗兔/小鼠IgG(1 ∶3 000)孵育2 h，超敏ECL發光法檢測蛋白條帶。

1.6 HUVECs攝取CM-DiR染料標記的EC109-ex

CM-DiR染料(5 μL/mL)加入EC109-ex，充分混勻后于37 ℃避光孵育30 min。孵育結束后混合液轉移至100 kDa MWCO超濾離心管，加入10倍體積PBS，輕柔吹打混勻，4 ℃、1 500×g離心30 min，去除未結合的CM-DiR 染料，收集超濾離心管中的濃縮液，經0.22 μm的濾器除菌后置于新的EP管中，即為CM-DiR染料標記EC109-ex。將HUVECs以3×104/mL密度接種于細胞玻片，待細胞完全貼壁后加入CM-DiR染料標記的EC109-ex，37 ℃孵育48 h。以4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌，加入Hoechst33342染核10 min，PBS洗滌，封片后采用熒光顯微鏡觀察CM-DiR標記的EC109-ex在HUVECs內定位。

1.7 Transwell侵襲實驗

5 μg/mL和10 μg/mL EC109-ex處理24 h的HUVECs經0.25%胰蛋白酶消化，無胎牛血清H-DMEM制成細胞懸液，調整細胞密度為3×105/mL，充分混勻后，加入鋪有Matrigel膠的 Transwell小室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的H-DMEM，37 ℃培養12 h。取出Transwell小室，棉簽去除未透膜細胞，置于4%多聚甲醛室溫固定30 min，結晶紫染色10 min，于顯微鏡下觀察拍照，隨機選取上下左右高倍鏡視野進行細胞計數。重復實驗5次，取每視野平均數作為實驗結果。

1.8 細胞成管實驗

吸取Matrigel基質膠100 μL均勻平鋪于24孔細胞培養板孔底，置于37 ℃恒溫培養箱中3～4 h，使基質膠充分凝固。胰蛋白酶消化HUVECs，用含10%胎牛血清的H-DMEM重懸細胞，終濃度為1.0×105/mL。實驗組加入5 μg/mL和10 μg/mL的EC109-ex，對照組加入等體積PBS。EC109-ex或PBS作用24 h后HUVECs(5.0×104個)均勻接種于基質膠上，37 ℃恒溫培養箱培養24 h，倒置生物顯微鏡下觀察并拍攝管腔形成。重復實驗5次，采用Image J軟件對每組管樣結構的節點、血管分支數和總長度進行計數。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 EC109-ex的鑒定及EC109-ex在HUVECs內的分布

透射電子顯微鏡觀察顯示，EC109-ex為球形的膜性小囊泡，膜結構完整，直徑為70～150 nm(圖1A)。蛋白質印跡結果證實EC109-ex表達外泌體特異性標志物CD9和CD63(圖1B)。采用CM-DiR染料標記EC109-ex，進行外泌體攝取實驗，熒光顯微鏡下可見經CM-DiR染料標記的EC109-ex分布在HUVECs胞質及核周圍。表明EC109-ex可被HUVECs攝取(圖1C)。

A:透射電鏡觀察EC109-ex結構(×30 000); B: 蛋白質印跡檢測外泌體標志蛋白; C: 熒光顯微鏡觀察CM-DiR染料標記的EC109-ex在HUVECs內分布(×400)

2.2 EC109-ex促進HUVECs的侵襲

Transwell實驗結果顯示，與對照組相比，EC109-ex 5 μg/mL刺激24 h后實驗組侵襲細胞數目顯著增加，而EC109-ex 10 μg/mL組侵襲細胞數目更多(圖2)。由此提示EC109-ex能夠顯著提升HUVECs的侵襲能力。

①：對照組；②：EC109-ex 5 μg/mL組；③：EC109-ex 10 μg/mL組。a: P<0.01，與對照組比較；b: P<0.01，與5 μg/mL組比較圖2 Transwell實驗檢測EC109-ex促進HUVECs的侵襲(×40)

2.3 EC109-ex促進HUVECs的小管形成

倒置生物顯微鏡觀察顯示，對照組HUVECs小管形成較少，僅可見不完全閉合的多邊形。而EC109-ex處理組含有閉合的管腔樣血管形態，EC109-ex 10 μg/mL組的成管腔樣血管形態較5 μg/mL組更加完整。與對照組相比，EC109-ex處理組的成管數、交叉點數明顯增加，EC109-ex 10 μg/mL組增加更加明顯。見圖3。結果表明EC109-ex可促進HUVECs的成管能力。

2.4 EC109-ex促進HUVECs血管形成特異標志表達

蛋白質印跡結果顯示，與對照組相比，EC109-ex 5 μg/mL作用組HUVECs CD31、CD34表達上調，而10 μg/mL作用組CD31、CD34和VEGF表達都顯著上調，見圖4。由此表明EC109-ex可促進HUVECs的血管形成相關標志物的蛋白表達。

①：對照組；②：EC109-ex 5 μg/mL組；③：EC109-ex 10 μg/mL組。a: P<0.05，b: P<0.01，與對照組比較；c: P<0.01，與5 μg/mL組比較圖3 EC109-ex促進HUVECs的小管形成(×40)

①：對照組；②：EC109-ex 5 μg/mL組；③：EC109-ex 10 μg/mL組。a: P<0.01，與對應的對照組比較

3 討論

食管癌的發病率和致死率較高，總體預后差，5年生存率為15%～25%[1-2,13]。食管癌細胞的高侵襲性和易轉移性是影響患者預后的主要因素。血管生成在食管癌等腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移和轉移過程中發揮著關鍵作用。腫瘤血管一方面為新生的腫瘤細胞提供新陳代謝所需的氧氣、蛋白質和其他營養物質，同時也可以促進腫瘤細胞從原發部位向遠處轉移、定居，導致腫瘤惡化[14]。研究表明，腫瘤細胞通過旁分泌效應調控血管周圍環境和內皮細胞增殖、遷移。抑制食管癌血管新生是食管癌治療的重要組成部分。

外泌體含有來源細胞的各種核酸、蛋白質、脂質、細胞因子等[6, 15]，是細胞間通訊的信息載體。腫瘤細胞分泌的外泌體在腫瘤血管生成和轉移過程中發揮重要作用[9, 16]。研究表明乳腺癌細胞可通過外泌體向細胞外轉運miR-939，下調血管內皮細胞鈣黏蛋白，增加體外血管通透性[17]。結直腸癌外泌體可轉運miR-25-3p，下調內皮細胞血管內皮細胞生長因子受體2(VEGFR2)、緊密連接蛋白(tight junction protein 1, TJP1)等表達，提高血管通透性[18]。缺氧條件可刺激肺癌細胞分泌外泌體，通過轉運miR-23a抑制內皮細胞TJP1，增加血管通透性和癌細胞轉移[19]。也有研究表明，膠質母細胞瘤[20]、肝癌[21]、胰腺癌[22-23]、鼻咽癌[24]和胃癌[25]等多種腫瘤細胞來源的外泌體含有各種長鏈非編碼RNA和蛋白質，可誘導毛細血管出芽、新生，是新生血管形成的有效誘導劑。抑制腫瘤細胞來源的外泌體分泌，則可抑制腫瘤的增殖、遷移和腫瘤血管生成[26-27]。目前，有關食管癌細胞外泌體調控血管內皮細胞成管的報道較少。本實驗研究結果表明，與對照組比較，EC109-ex在孵育30 min后即可被HUVECs成功攝入。EC109-ex作用后HUVECs的侵襲能力明顯提升，成管能力顯著增加。這些結果提示EC109-ex可進入血管內皮細胞，促進血管內皮細胞的侵襲和成管能力。

CD31、CD34是腫瘤研究中常用的血管內皮細胞標志物[28]。同時，CD31存在于內皮細胞間緊密連接處，參與血管生成和整合素的激活。CD34分子是高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白，選擇性地表達于人類及其他哺乳動物的內皮細胞表面，在介導內皮細胞間黏附中發揮著重要作用。VEGF可通過促進受體介導的毛細血管內皮細胞增殖從而誘導毛細血管管腔形成，還可通過自分泌及旁分泌途徑引起血管通透性增加，改變腫瘤細胞間隙，在腫瘤細胞遷移和侵襲中起重要作用，是食管癌過度表達的血管新生刺激因子[29-30]。本研究結果證實EC109-ex能夠促進HUVECs的CD31、CD34和VEGF的蛋白表達，提示EC109-ex的促血管形成作用可能與其調控VEGF的表達有關。然而，EC109-ex在動物模型中是否具有類似的促血管效果需要進一步證實。此外，EC109-ex中發揮促血管形成的關鍵分子及其相關調控機制仍有待進一步探討。

綜上所述，本研究初步證實了食管癌細胞來源外泌體能夠進入內皮細胞，誘導其侵襲、小管形成，并上調血管標志物和血管生長因子的表達。這為進一步靶向食管癌細胞釋放外泌體，建立食管癌治療的有效手段提供了重要的思路和方向。