基于液相色譜-串聯質譜平臺測定血清皮質醇的實驗方法與質量評估

王菀葉

(南京市第一醫院核醫學科，江蘇 南京 210006)

皮質醇是神經內分泌系統疾病的生物標志物，其過度分泌與庫欣綜合征有關，而皮質醇缺乏與艾迪生病有關。皮質醇參與了人體的葡萄糖代謝、血壓調節等基礎過程[1]，在人體功能良好運轉中起到重要的作用。近年來，許多精神健康相關的研究也將皮質醇檢測納入其中[2-3]。因此，血清皮質醇檢測具有重要的臨床價值。

電化學發光免疫分析法是目前廣泛應用的皮質醇檢測方法，其優點是自動化程度高，檢測迅速快捷且重復性好，而免疫學檢測法主要的兩個缺點是特異性差和交叉反應。由于皮質醇主要是以與皮質醇結合球蛋白(cortisol-binding globulin，CBG)結合的形式存在于血液循環中，免疫法檢測的皮質醇濃度實際上大于血液中游離態的皮質醇濃度[4]。而且庫欣綜合征的女性患者數與男性患者數比為10 ∶1[5]，女性懷孕期間CBG明顯升高，因此，免疫學檢測方法并不能真實反映患者的皮質醇水平。另外，可的松、 17α-羥孕酮(17α-OHP)和地塞米松對免疫法檢測有交叉反應的干擾[6]。而異嗜性抗體等干擾物質會使免疫學檢測到的皮質醇濃度偏低[7]。相較而言，高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)平臺對皮質醇等類固醇物質的檢測有更好的準確性和特異性。美國國家標準技術研究院(the National Institute of Standards and Technology，NIST)的Tai等[8]在HPLC-MS/MS平臺建立了血清皮質醇的檢測方法，并提出將質譜法作為檢測皮質醇的參考方法。Keevil等[9]提出液相色譜的高分離性能與質譜平臺的高選擇性能強強聯合，更加適合類固醇物質的檢測。朱宇清等[10]建立并驗證了質譜方法適用于血清皮質醇的檢測。鑒于目前國內相關臨床檢測方法和質量評價研究報道較少，有必要開發和驗證血清皮質醇的HPLC-MS/MS分析規范，為建立中國人群的健康參考標準提供借鑒。

本研究詳細介紹了在HPLC-MS/MS平臺上如何建立檢測血清皮質醇的實驗方法及實驗參數的優化過程。在性能驗證與質量評估中，引入了Westgard等[11]推薦的六西格瑪分析，更直觀地對實驗方法做出評價，對實驗室質量管理提供了更有針對性的參考。

1 材料與方法

1.1 樣品與質控品

純皮質醇凍干粉(批號Q3880-000)、皮質醇-d4凍干粉(批號Q3880-040)為澳大利亞PM Separations公司產品；12個皮質醇外部質控樣品(編號為35-01至35-12)為澳大利亞皇家檢驗學會質控品(The Royal College of Pathologists of Australasia Quality Assurance Programs, RCPAQAP)，濃度依次為988，34，427，614，239，801，427，34，988，239，614和801 nmol/L，為美國賽默飛科技公司產品。

1.2 儀器與耗材

1290 Infinity高效液相色譜儀，6490 三重四級桿質譜儀，Poroshell 120 EC-C18分析柱(3.0 mm×50 mm, 粒徑2.7 μm，批號B13236)均為美國安捷倫公司產品。甲醇(LC級 、批號1.06018.4000)，乙酸乙酯(批號1.00868.2500)，正己烷(LC級，批號1.04391.2500)均為德國默克集團產品；甲基叔丁基醚(Methyl tert-butyl ether，MTBE)批號34875，為美國生命科學與高科技集團公司產品；SeraCon類血清稀釋劑為澳大利亞Abacus ALS公司產品。

1.3 儲備液、工作液、標準品與質控品的制備

稱取純皮質醇凍干粉0.010 2 g，加入500 mL甲醇中，制成濃度為56 280 nmol/L的皮質醇儲備液；稱取皮質醇-d4凍干粉0.002 g，加入1 000 mL甲醇中，制成濃度為5 580 nmol/L的內標物儲備液。將兩種儲備液儲存于-18 ℃。

將355 μL 皮質醇儲備液風干后加入10 mL 類血清稀釋劑，制成濃度為2 000 nmol/L的皮質醇工作液；取2 509 μL內標物儲備液加入7 491 μL甲醇，制成濃度為1 400 nmol/L的內標物工作液。用皮質醇工作液和類血清稀釋劑配置6個水平的標準品，濃度分別為0，400，800，1 200，1 600和2 000 nmol/L。低、中、高3個水平的質控品濃度分別為100，500和1 500 nmol/L。

1.4 血清樣本的預處理

吸取血清樣本80 μL，水(LC級)80 μL，甲醇80 μL，內標物儲備液80 μL，加入1.5 mL離心管內，渦旋振蕩1 min，瞬時離心后加入液液萃取的溶劑1 mL，渦旋振蕩5 min, 室溫下3 000 r/min離心5 min，將500 μL上清液轉移至干凈的1.5 mL離心管中，36 ℃在生物安全柜內風干，用200 μL甲醇溶解后渦旋混勻20 s，轉入上樣瓶。

1.5 實驗條件

使用正離子模式的電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI)，多反應監測模式(multiple reaction monitoring, MRM)進行監測分析，霧化氣體為氮氣，霧化氣壓力為60 psi，脫溶劑溫度為350 ℃，離子源溫度維持在150 ℃，錐孔電壓40 V。液液萃取的溶劑、碰撞能量、流動相梯度、流速、柱溫與進樣量分別通過詳細的優化實驗選擇。

2 結果

2.1 實驗參數的優化

2.1.1 液液萃取的溶劑選擇 使用正己烷、乙酸乙酯和MTBE溶劑做皮質醇的液液萃取，比較皮質醇峰的高度、形狀和背景干擾。本實驗中正己烷未能萃取出皮質醇，圖1比較了MTBE與乙酸乙酯萃取的皮質醇峰，由于乙酸乙酯萃取出了疑似為同分異構體的雜峰，被認為萃取不穩定，最終選取MTBE作為本實驗的溶劑。

a： MTBE萃取的皮質醇峰；b： 乙酸乙酯萃取的皮質醇峰；c： 可能是長期儲存而產生的同分異構體

2.1.2 碰撞能量的優化 使用皮質醇儲備液與內標物儲備液稀釋10倍后上樣，液相分析柱替換為普通連接柱，從而消除液相層面的干擾，記錄碰撞能量從15 eV到50 eV下離子的產量。結果如圖2所示，在30 eV下定量離子和定性離子的產生量均為最高。因此本實驗中的皮質醇的離子躍遷分別選擇為定量離子363 m/z→121 m/z 和定性離子363 m/z→97 m/z，碰撞能量為30 eV；而皮質醇-d4的離子躍遷用同樣的方法確定為定量離子367 m/z→121 m/z，碰撞能量為 25 eV。

圖2 皮質醇定量離子(363→121)和定性離子(363→97)在不同碰撞能量下的產量對比

2.1.3 流動相成分與時間表 本實驗液相色譜儀流動相A的成分為2%甲醇溶液(含有0.1%甲酸)，流動相B為含有0.1%甲酸的甲醇。為了得到最優的流動相占比，從100%流動相B開始，依次降低流動相B的百分比，得到不同高度和寬度的皮質醇等度洗脫峰。比較可得在流動相B占90%時皮質醇的洗脫為最優(圖3)。考慮到皮質醇的疏水性，在流動相時間表的開頭和結尾需要使用盡可能少的流動相B來減少丟失。綜合以上條件，則本實驗中梯度流動相設計為：0→2 min 35%B；2→4 min 35%B→90%B；4→6.5 min 90%B；6.5→8 min 100%B；8→8.5 min 100%B→35%B；8.5→11 min 35%B。

圖3 比較不同梯度的流動相B洗脫得到的皮質醇等度峰

2.1.4 流速、柱溫與進樣量 本實驗測試了0.2, 0.3, 0.4和0.6 mL/min 4種流速，選擇了峰的高度和寬度最為理想的0.3 mL/min作為最終流速。相同流速下，分別測試2, 4, 5, 6, 7, 8和10 μL共7種進樣量和45 ℃ 、20 ℃柱溫，最終選擇柱溫為20 ℃，進樣量為6 μL，皮質醇和內標物的保留時間為6.6 min。

2.1.5 離子抑制 為了排除磷脂的離子抑制作用的干擾，本實驗監測了184 m/z和104 m/z的出峰情況，得到磷脂的出峰時間為2 min，對皮質醇及其內標物的檢測不存在干擾。

2.2 性能驗證與質量評估

2.2.1 標準曲線與定量下限 皮質醇的標準曲線方程為Y=8.147×10-4X+0.003 44(r=0.999 9)，線性關系良好。使用RCPAQAP外部質控品最低濃度(34 nmol/L),分別稀釋5倍、10倍、100倍各1對，檢測它們的信噪比(S/N)，用其中S/N比值均大于10的1對樣品(1 ∶10)的檢測濃度[12]，求得本實驗中的最低定量下限為2.19 nmol/L。

2.2.2 精密度 同批次檢測步驟“1.3”中配置的低、中、高3個水平的質控品各10個，得到批內精密度為3.79%。將低、中、高3個水平的質控品分5個批次檢測，得到批間精密度為7.48%。

2.2.3 偏倚(不確定度)與回歸分析 檢測12個RCPAQAP質控品，將檢測值與靶濃度相比較做戴明回歸分析(圖4)，得到的方程為Y=1.096X+2.1，計算2個最接近皮質醇醫學決定水平[13]的濃度的偏差，分別為9.90%和8.40%，它們的平均值9.15%為本實驗方法的偏倚(不確定度)[14]。由此求得本實驗方法的總誤差為21.49%。將已知濃度的2支RCPAQAP質控品(614和239 nmol/L)等量相加，檢測3次，得到回收率為83%。

圖4 RCPAQAP外部質控品的戴明回歸分析

2.2.4 六西格瑪分析 本實驗使用六西格瑪質量分析，用方程sigma=(總誤差-偏倚)/精密度進行計算[11]。此處的允許總誤差參考美國CLIA′88能力驗證計劃的分析質量要求：皮質醇的允許總誤差為靶值±25%。六西格瑪圖表使用允許精密度作為x軸，允許不確定度作為y軸，當一個實驗方法的sigma>4時，認為是理想的實驗方法，而sigma<3時認為不在統計學程序控制范圍內[15]。計算得到本實驗方法的sigma為4.22，圖5顯示工作點落在4 sigma與5 sigma之間，說明本實驗方法較為理想。

3 討論

不同溶劑與皮質醇之間的親和力不同，提取效率不同，對人體的毒性也不同，因此液液萃取的溶劑對于產物的提純起到至關重要的作用。Honour[16]提出在選取溶劑時，檢測時長和溶劑的毒性也應考慮在內。因此最終選擇了峰形最好，提取最穩定，毒性不算很強的MTBE作為液液萃取的溶劑。

實驗中值得注意的是，為了防止降解的影響，工作液需要在每批次實驗前用儲備液新鮮稀釋而成。皮質醇-d4是本實驗的內標物，由于甲醇可以起到沉淀蛋白的作用[17]，而內標物的濃度應該在標準曲線范圍之內(0～2 000 nmol/L)，因此使用甲醇配置了1 400 nmol/L的工作液。

MRM除了監測定量離子、定性離子之外，還要監測次顯著的離子躍遷[18]和離子抑制作用。在本實驗中，皮質醇的檢測并沒有受到磷脂的離子抑制作用的影響。在今后進一步的實驗優化中，也可以監測磷脂之外其他會產生基質效應的脂類，如膽固醇、甘油酯[19]。

在本研究的流動相時間表中，皮質醇洗脫之前使用了35%的流動相B，低于Jung等[20]和Hawley等[21]推薦使用的40%的流動相B作為標準的解決方案。本研究小幅下調了流動相B的比例，是考慮到皮質醇的疏水性和液液萃取的設備較為簡化，以此來規避可能出現的提取率不高的問題。Jung等[20]研究指出液液萃取的重構步驟中使用的甲醇比例應該與流動相時間表的初始比例相一致，然而考慮到上樣小管在冷凍保存時純甲醇的穩定性更優，本研究重構步驟使用了100%純甲醇以達到一個更精確易操作的重構效果。

本研究在方法學驗證時得到批內精密度和批間精密度分別為3.79%和7.48%。Biswas等[22]指出批間精密度更能代表實驗方法的整體精密度，因此確定本方法的精密度為7.48%。從戴明回歸分析圖上可以看出，本研究中濃度高的樣品有產生更大偏倚的趨勢。本實驗的精密度7.48%，偏倚9.15%，總誤差21.49%，均在Westgard數據庫列出的理想的生物學多樣性指標范圍內(精密度7.6%，偏倚10.26%，總誤差22.8%)，也符合美國CLIA′88能力驗證計劃的分析質量要求，并且在六西格瑪分析中得到了理想的結果。

值得提出的是，在精密度實驗中使用的樣品濃度為100，500和1 500 nmol/L，這有可能為六西格瑪分析的計算帶來問題。Westgard建議驗證精密度和不確定度的樣品濃度應與醫學決定水平一致[23]?？紤]到RCPAQAP樣品的濃度更接近于醫學決定水平，進一步的實驗優化可以使用同樣的RCPAQAP樣品做精密度和不確定度分析。

綜上所述，本研究在HPLC-MS/MS平臺上建立了血清皮質醇的檢測方法，優化了色譜分離和質譜檢測的參數，并對其精密度、偏倚(不確定度)、定量限和六西格瑪分析等做了方法學驗證與質量評估，最終得到一個精密度高、準確性好、理想且高效的策略。