核酸檢測技術在酶聯(lián)免疫吸附法漏檢HIV和HBV血樣篩查中的應用

【摘要】目的：于酶聯(lián)免疫吸附法漏檢的HIV（人類免疫缺陷病毒）和HBV（乙型肝炎病毒）血樣篩查中應用核酸檢測技術的效果進行研究。方法：對2018年1月到2020年1月的4000份經兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測后各項指標均呈陰性的無償獻血者血液標本進行研究，標本經六混樣兩種試劑做核酸檢測，對陽性標本用兩種試劑拆分做膽管核酸檢測，總結檢測結果。結果：在4000份經兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測后各項指標均呈陰性的無償獻血者血液標本中，經核酸檢測技術篩查出有4份是乙型肝炎病毒陽性標本、1份是人類免疫缺陷病毒陽性標本。結論：血液標本即便是經兩次酶聯(lián)免疫吸附法檢測時，仍存在漏檢人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒的風險，應用核酸檢測技術可有效篩查出漏檢人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病的標本，而進一步確保用血質量、安全。

【關鍵詞】輸血；人類免疫缺陷病毒；乙型肝炎病毒；酶聯(lián)免疫吸附法；核酸檢測技術；應用價值

[中圖分類號]R446.6 [文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2021）07-0141-02

輸血是臨床重要的一種治療方式，可及時補充患者血容量，挽救生命。在輸血中，要嚴格確保輸血質量以及安全，但人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒等可經血傳播的病毒一直是輸血安全上最受人們關注的一個問題[1]。酶聯(lián)免疫吸附法是以往血液常規(guī)篩查的一種手段，可檢測無償獻血者血液中的病毒抗體、病毒抗原，并以此當做血液感染與否的指標[2]。酶聯(lián)免疫吸附法可明顯降低通過輸血傳播人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒等風險，但是由于抗體、抗原檢測是標志物的間接檢測方法，窗口期較長，并會受病毒變異、免疫沉默性感染以及病毒滴度等因素的影響，導致經輸血傳播人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒等風險仍然存在[3]。而核酸檢測技術是對病毒核酸直接進行檢測，其檢測窗口期明顯縮短，而且在窗口期也能檢測出人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒，同時還可避免因病毒變異、免疫沉默性感染以及病毒滴度等因素造成的漏檢，彌補酶聯(lián)免疫吸附法的不足，進一步的降低經輸血傳播人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒等風險[4]。本課題主要是探究酶聯(lián)免疫吸附法漏檢的HIV和HBV血樣篩查中應用核酸檢測技術的效果，請見下文。

1 資料和方法

1.1臨床資料 對2018年1月到2020年1月的4000份經兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測后各項指標均呈陰性的無償獻血者血液標本進行研究，采集血液后，在核酸檢測分離膠試管中保存，4 h內進行離心，3000 r/min，20 min，之后在4℃的環(huán)境下進行保存。

1.2方法 （1）試劑和儀器：低溫離心機，瑞士IVD混樣儀，Cobas AmpliPrep、Cobas TaqMan，Cobsa TaqScree MPX試劑盒，Cobsa TaqScree洗液、Cobsa TaqScree MPX V2對照試劑盒，Cobsa TaqScree MPX對照試劑盒。（2）檢測方法：①酶聯(lián)免疫吸附法：標本做兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測，加樣器自動加樣，全自動酶聯(lián)免疫吸附分析儀對抗乙型肝炎表面抗原、人類免疫缺陷病毒抗體、乙型肝炎病毒抗體進行兩次檢測，按《中國輸血技術操作規(guī)程》關于血站部分的標準對檢測結果進行判定當標本的酶聯(lián)免疫吸附法檢測是陰性，而核酸檢測是陽性時，重新取樣做酶聯(lián)免疫吸附法檢測。②核酸檢測技術篩查：在生物安全柜中，打開標本蓋，在樣本架上放置，混樣儀自動開展六混樣處理，平行混合兩份。一份是經全自動血液病毒核酸檢測儀+MPX試劑盒開展核酸檢測，對人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒以及丙型肝炎病毒進行檢測。另外一份經另外一臺檢測儀+MPX V2試劑盒開展核酸檢測，其檢測內容同上一份一致。當六混樣試管陽性，就做拆分單管核酸檢測。六混樣初篩結果是兩種試劑均判定是陽性，而拆分檢測結果也是陽性，則樣本核酸檢測就是陽性。

2 結果

2.1總結窗口期酶聯(lián)免疫吸附法的兩次檢測結果 自動加樣后（加樣器），在兩臺全自動酶免分析儀上使用兩種不同廠家試劑進行兩次乙型肝炎表面抗原、人類免疫缺陷病毒抗體、乙型肝炎病毒抗體的酶聯(lián)免疫吸附法檢測，光密度值分別是0.002、0.047，而判定是陰性。核酸檢測發(fā)現(xiàn)該標本是人類免疫缺陷病毒陽性，從血袋再次取標本同時使用兩種試劑進行檢測，光密度值分別是0.006、0.040，再次判定酶聯(lián)免疫吸附檢測結果仍呈陰性。

2.2總結漏檢人類免疫缺陷病毒標本的核酸檢測結果Cobas TaqScreen MPX的六混樣聚合酶鏈式反應擴增曲線上，熒光探針在第19.2個循環(huán)時就有靶標核酸片段檢出，但內置控沒有擴增出來，而該批次的其他陰性樣本檢測中均擴增出內置控，推測該樣本的病毒載量濃度過高，使反應被抑制。Cobas TaqScreen MPX第二代制劑的六混樣聚合酶鏈式反應擴增曲線上，熒光探針在第21.8個循環(huán)時就有靶標核酸片段檢出，該試劑選擇多熒光探針技術，CH4是內置控、CH1是人類免疫缺陷病毒，同內置控多熒光探針技術相比，六混樣檢測的靈敏度較很好，且在高濃度抑制擴增上內置控也有改進。

2.3總結漏檢人類免疫缺陷病毒標本的核酸檢測拆分單檢結果 單管核酸檢測的聚合酶鏈式反應擴增曲線上，熒光探針在第16.4個循環(huán)時就有靶標核酸片段檢出，說明濃度更高，但仍未擴增出內置控，從而更有理由推斷是其病毒載量濃度過高，使反應被抑制。所以，經陰性血漿把標本稀釋400倍，之后再進行核酸檢測，Cobas TaqScreen MPX試劑復孔進行單管核酸檢測，熒光探針在第24.7個循環(huán)時就有靶標核酸片段檢出，在第30.3個循環(huán)時內置控在擴增曲線開始抬頭，樣本稀釋后不在抑制內置控擴增，但稀釋后樣本仍遠提前于內置控擴增。在第19個循環(huán)時CH1探針就有靶標核酸片段檢出，判定樣本人類免疫缺陷病毒陽性。

2.4總結酶聯(lián)免疫吸附法漏檢乙型肝炎病毒的情況在4000份血液標本中，核酸檢測工檢出4份乙型肝炎病毒陽性標本，檢出率是0.10%。

3 討論

在本課題的4000份經兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測后各項指標均呈陰性的無償獻血者血液標本中，經核酸檢測技術篩查出有4份是乙型肝炎病毒陽性標本、1份是人類免疫缺陷病毒陽性標本。從而得知：即便是經過兩遍酶聯(lián)免疫吸附法檢測，無償獻血者血液標本仍存在人類免疫缺陷病毒感染、乙型肝炎病毒感染的情況，影響用血安全[5]。對于核酸技術來說，盡管可篩查出酶聯(lián)免疫吸附法對于人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒的漏檢標本，但是不能徹底的消除乙型肝炎病毒窗口期，不過能夠把經輸血傳播乙型肝炎病毒的風險降到最低[6]。

目前在全世界范圍內，抗體檢測相關試劑已發(fā)展到第四代，對于前三代試劑來說，主要是對兩種抗體進行檢測，而第四代試劑能夠同時檢測免疫球蛋白M抗體、免疫球蛋白G抗體、P24抗原，同時把窗口期縮短到三周[7]。在本課題中，是對血液標本使用兩種不同廠家的第四代試劑進行兩次檢測，經核酸檢測技術對兩次酶聯(lián)免疫吸附法檢測均呈陰性的樣本再次進行篩查，結果表示篩查出了人類免疫缺陷病毒陽性、乙型肝炎病毒陽性的標本。說明：在臨床用血的酶聯(lián)免疫吸附法檢測中，仍存在一定安全隱患，需開展核酸檢測來確保臨床用血安全[8]。

在感染者血液標本中，最早被檢測出來的是病毒核酸，且呈一過性的高水平，之后水平有所下降。于本課題中，在第19個循環(huán)時CH1探針就有靶標核酸片段檢出，明顯提前于在第30.3個循環(huán)時內置控在擴增曲線開始抬頭，所以推斷同內置控病毒載量水平相比，其水平是相當高的，但經酶聯(lián)免疫吸附法并未檢測出免疫球蛋白M抗體、免疫球蛋白G抗體、P24抗原等，說明該樣本很可能是處于最早期感染階段，病毒核酸一過性高水平，剛好P24抗原水平下降但抗體未升高或者P24抗原未出現(xiàn)而導致漏檢[9]。同第四代酶聯(lián)免疫吸附法試劑比較來說，核酸檢測技術把窗口期縮短了五天，證實縮短窗口期可確保輸血安全[10]。

總之，血液標本即便是經兩次酶聯(lián)免疫吸附法檢測時，仍存在漏檢人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒的風險，應用核酸檢測技術可有效篩查出漏檢人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病的標本，而進一步確保用血質量、安全。

參考文獻：

[1] 張毓， 孫國棟， 田豐， 等. 血站核酸實驗室混樣檢測系統(tǒng)HBV DNA單陽性率分析[J]. 醫(yī)學動物防制， 2020， 36（10）： 930-933.

[2] 張毓， 田豐， 孫國棟， 等. 化學發(fā)光法應用于無償獻血者HBsAg陰性/HBV DNA陽性標本檢測及其與核酸檢測的關聯(lián)分析[J].中國輸血雜志， 2020， 33（7）： 651-654.

[3] Laura G. Wesolowski， Kelly Wroblewski， Spencer B. Bennett， et al. Nucleic acid testing by public health referral laboratories for public health laboratories using the U. S. HIV diagnostic testing algorithm[J]. Journal of Clinical Virology， 2015， 65.

[4] 林詩雅， 王淏， 杜榮松， 等. 廣州地區(qū)獻血者HBV核酸檢測非重復反應性樣本確認及追蹤研究[J]. 熱帶醫(yī)學雜志， 2020， 20（3）： 364-367.

[5] 赫曉霞， 馬潔瓊， 徐冰， 等. 美國CDC推薦HIV核酸檢測策略與核酸定量檢測替代策略[J]. 中國艾滋病性病， 2020， 26（2）： 214-216， 221.

[6] 程衛(wèi)芳， 周學勇， 崔偉婭， 等. 單核酸HBV DNA/聯(lián)檢反應性獻血者歸隊可行性分析[J]. 中國輸血雜志， 2019， 32（12）： 1250-1253.

[7] 張毓， 孫國棟， 張麗， 等. HBcAb陽性獻血者隱匿性HBV感染的血清學與核酸檢測結果分析[J]. 醫(yī)學動物防制， 2020， 36（2）： 159-162.

[8] 朱振坤， 俞曉春， 薛靜俊， 等. 全自動核酸提取平臺高敏HBV DNA定量檢測的性能評價[J]. 中國病毒病雜志， 2019， 9（3）： 214-219.

[9] 崔曉蕾. 血站HBV篩查ELISA陰性NAT陽性標本的確認結果分析[J]. 中國輸血雜志， 2019， 32（3）： 251-254.

[10] 王燕. 核酸檢測技術在酶聯(lián)免疫吸附法漏檢HIV和HBV血樣篩查中的應用[J]. 中國農村衛(wèi)生， 2016，25（6）： 44-45.

作者簡介：崔永利（1977.01-）， 男， 漢族，山東淄博人，淄博市中心血站，主管技師。E_mail：CYL0533@126.com