環絲氨酸與其他二線抗結核藥物體外相互作用的研究

屈世林 張宇 徐立民 曾瑋 劉珂偉 張立群

【摘要】目的：探討環絲氨酸（CS）與其他二線抗結核藥物的體外相互作用。方法：分別選擇敏感菌株及同時耐異煙肼利福平的臨床分離菌株各 10 株，濃度梯度法測定 CS、莫西沙星（MFX）、卷曲霉素（CM）、對氨基水楊酸（PAS）和丙硫異煙胺（PTO）的最低抑菌濃度（MIC）值，通過計算分級抑菌濃度指數，觀察環絲氨酸與其他抗結核藥物聯合使用時是否存在相互作用。結果：CS 聯合 CM、CS 聯合 PAS 能檢測到協同作用；CS 聯合 MFX、CS 聯合 PTO 未檢測到相互作用。CS 與 4 種抗結核藥的分級抑菌濃度指數在敏感和耐多藥（MDR）菌株間的差異無統計學意義（P>O.05）。結論：敏感及MDR結核分枝桿菌臨床分離株的體外研究結果顯示 CS 與 CM 和 PAS 有協同效應，與 MFX 和 PTO 無相互作用。

【關鍵詞】環絲氨酸；微量稀釋棋盤法；協同作用；體外研究

【中圖分類號】R52 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-5249（2021）06-0251-02

基金項目：2017北京結核病診療技術創新聯盟CTCTC科研項目基金支持項目（2017KYJJ005）

結核病是嚴重的全球公共衛生問題，耐藥結核分枝桿菌的出現是造成結核病疫情居高不下的重要原因之一。WHO多次發布耐藥結核病的診治指南，其中CS因其口服吸收良好、體內分布廣泛、不易產生耐藥且與其他抗結核藥物無交叉耐藥性，在2018年指南更新中將CS作為耐藥結核病治療方案的B組藥物，常與其他抗結核藥物聯合應用。本研究通過測定CS對敏感及MTB臨床分離株的體外抑菌作用，探討CS與其他抗結核藥物聯用時的體外相互作用，為臨床合理使用CS提供實驗室依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗用菌株：選擇荊州市胸科醫院細菌室保存的標準菌株H37Rv菌株1株，經絕對濃度法藥敏試驗確定為敏感的臨床分離菌株10株、同時耐異煙肼（H）和利福平（R）的臨床分離菌株10株。敏感菌株10株均為臨床初治結核病患者菌株，耐藥菌株10株，其中初始耐藥患者2例，其余8例均為臨床復治患者，其中使用左氧氟沙星大于1月者3例，使用阿米卡星大于1月者2例，均未使用莫西沙星（MFX）、丙硫異煙胺（PTO）、對氨基水楊酸鈉（PAS）及卷曲霉素（CM）。

主要藥物和試劑：CS、MFX、CM、PTO、PAS均購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 濃度梯度法測定幾種抗結核藥物的MIC

配制CS，MFX，CM，PAS， PTO， 使藥物的儲存濃度為320 μg/mL。將藥物稀釋于10 %OADC 7H9培養基，使其終濃度分別為0.015 μg/mL、0.03 μg/mL、0.06 μg/mL、0.125 μg/ mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/ mL、8 μg/mL、16 μg/mL。將20 μL的含藥培養基加入96孔板中并在無菌安全柜中風干后待用。

取適量對數生長期的菌株，磨菌后用生理鹽水比濁至1個麥氏單位（約107 cfu/mL），用7H9培養液1∶100稀釋，使菌液濃度為105 cfu/mL。取稀釋后的菌液200 μg/mL孔加入96孔板中，同時設置100 %、10 %、1 %菌量生長陽性對照孔，封板裝入自封塑料袋后置 37 ℃溫箱培養。以接種當天為第0天，前3天觀察培養板狀態是否有肉眼可見菌落生長。如果出現渾濁或沉淀需要進行鑒定，以確認是否發生污染。從第7天、10天、14天分別觀察培養板上菌落生長情況并記錄結果。以孔底出現肉眼可見的白色菌體沉淀為陽性。 MIC定義為孔底可見菌體沉淀小于10%對照孔的最低藥物濃度。

1.2.2 觀察CS與其他抗結核藥物聯用的體外相互作用

選取標準菌株H37Rv 1株、敏感臨床分離菌株10株、同時耐HR的臨床分離菌株10株，微量棋盤稀釋法測定CS與其他二線抗結核藥物的體外相互作用。將CS的1/4倍、1/2倍、1.0倍、2.0倍MIC濃度分別與MFX、PAS、CM、PTO 的1/4倍、1/2倍、1.0倍、2.0倍MIC濃度聯合應用，檢測方法同上，觀察各種聯合用藥作用下細菌的生長情況。

計算分級抑菌濃度指數（Fraction inhibition concentration index，FICI）計算公式為：濃度指數（FICI）=聯合藥敏時甲藥MIC/單獨藥敏時甲藥MlC+聯合藥敏時乙藥MIC/單獨藥敏時乙藥MlC，FICI≤0.5為協同；0.54為拮抗。

1.2.3 MIC測定的質量控制

每株菌重復實驗3次，最終取3次一致性最好的數值；每次進行操作時，均設H37Rv 標準菌株作為質控株。

1.3 統計學處理

數據采用SPSS 13.0軟件分析，CS對H37Rv、敏感和耐多藥菌株的MIC比較采用非參數秩和檢驗，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 濃度梯度法分別測定

標準菌株（H37Rv）、10株敏感菌株及10株耐HR菌株的CS、MFX、PAS、PTO、CM的MIC值，得到3組細菌的MIC值基本一致，分別為CS 2.0 μg/mL、MFX 0.03 μg/mL、CM 1.0μg/mL、PTO 0.125 μg/mL、PAS 0.06 μg/mL。

2.2 CS與其他抗結核藥物聯用對敏感和耐多藥菌株的體外相互作用

在耐多藥菌株中，1/4倍MIC濃度的CS與MIC濃度的MFX、PTO聯合時可達到90 %以上的抑菌效果；而與1/2倍MIC濃度的CM、PAS聯合時亦可達到90%以上的抑菌效果；而1/2倍MIC濃度的CS與1/2倍濃度的MFX聯合時可達到90 %以上的抑菌效果，與其他三種藥物均在1/4倍MIC濃度聯合時可達到90 %以上的抑菌效果（見圖1～4）。FICI（Cs+Mfx）=1.25、FICI（Cs+Cm）=0.75、FICI（Cs+PAS）=0.75、FICI（Cs+Pto）=1.25，提示CS與CM、PAS有協同效應，與MFX、PTO無相互作用。敏感菌株與耐藥菌株的結果一致。

3 討論

WHO于2018年推薦環絲氨酸作為治療MDR-TB的二線核心口服抗結核藥之一[1]。其抗菌作用機制是抑制細菌細胞壁粘肽的合成，從而使細胞壁缺損導致細菌耐酸能力減弱，起到殺菌和抑菌作用[2-3]，且與其他藥物無交叉耐藥。近年來，國內外含環絲氨酸治療方案對MDR-TB患者的治愈率為66 %～77 %，死亡率和復發率較低[4-5]。

CS最低抑菌濃度為25 mg/L。Deshpande[6]等學者通過結核中空纖維系統模型（the hollow fibersystem model of tuberculosis，HFS-TB）研究CS的藥物動力學，發現高濃度CS的殺菌作用與一線抗結核藥物及氟喹諾酮類藥物相當，提示CS并不是傳統意義上的抑菌藥物，高濃度環絲氨酸具有殺菌效果，但由于CS的神經精神副反應嚴重[7]，限制了該藥的使用劑量。雖然WHO推薦CS血藥濃度為25μg/ ml～30μg/ml是有效安全的，但臨床研究發現CS低血清濃度使用率達到44%[8]，大多數患者環絲氨酸的血藥濃度只能達到15μg/ml～20μg/ml。Seung等報道中低濃度CS使用率為71.2 %，且與對照組相比，CS低血清濃度使用并不影響患者2月末痰菌轉陰率，提示CS與其他抗結核藥物可能存在相互作用，從而加強了聯合用藥的效果。環絲氨酸與異煙肼合并用藥有輕度協同作用，但是針對目前異煙肼、利福平等一線抗結核藥物的耐藥日益嚴重的情況，急需尋找其他適合與環絲氨酸聯合使用且能產生協同效應的抗結核藥物。2018年WHO耐多藥結核病指南將注射劑及PAS由于不良反應被推薦停止使用。但在我國，由于抗結核新藥尚不能廣泛應用，而其他藥物高昂的價格亦限制了患者能夠全療程的應用，因此，從我國國情出發，現階段完全剔除注射劑及PAS可能是不明智的。所以，從二線藥物中尋找與環絲氨酸有協同作用的抗結核藥，并摸索合適的聯合用藥劑量顯得尤為重要。本課題對CS，CM，PAS，PTO之間的相互作用進行了研究，期望能夠指導臨床，在密切監測不良反應的同時合理用藥，明確藥物之間相互作用，這對于提高MDR患者的治愈率有重要意義。

有研究表示，環絲氨酸與異煙肼合并用藥有輕度協同作用，但是針對耐藥率日益嚴重的情況，急需尋找適合與環絲氨酸聯合使用且能產生協同效應的抗結核藥物。本次研究結果顯示，CS與CM及PAS聯合使用的FICI值均為0.75，提示CS與CM及PAS存在協同作用，這或許能夠解釋在CS中低濃度使用的MDR患者臨床治療方案中，仍然能夠取得較滿意的療效的原因，可能是因為方案中同時存在注射劑CM和PAS。但是MDR患者中CS聯合CM及PAS的治療方案與不含CM及PAS的治療方案的療效是否存在差異還有待進一步研究。

此外，環絲氨酸作為核心抗結核口服藥物，具有獨特的結構及作用機制，治療耐藥結核病的前景廣闊，但其耐藥現象不容忽視，應深入研究其耐藥機制以減少耐藥的發生。

參考文獻

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