近紅外光響應性復合納米顆粒介導光熱消融與自由基生成用于乳腺癌細胞的聯合治療

張靜靜，徐麗霞，劉蘇婉，劉勁靜，杜鳳移，張禮榮

(江蘇大學醫學院， 江蘇 鎮江 212013)

腫瘤光熱治療是一種新興的局部腫瘤消融技術，其原理是使用熱敏劑將外源近紅外光能轉換為熱能，進而導致腫瘤發生不可逆的損傷[1-2]，具有潛在的臨床應用前景[3-4]。傳統的治療手段主要有手術切除，化療和放療，但都存在一定的局限性，如手術切除創傷較大、化學療法不良反應較大，易耐藥；放射療法缺乏特異性，易引起系統毒性等。而光熱治療具有非侵入性，微創，精確可控和可重復治療等優勢，使用可調節的外部近紅外激光照射可以精確定位腫瘤，從而迅速有效地消融腫瘤而對周圍健康組織的損傷最小[5]。其中，聚多巴胺是一種由多巴胺在弱堿性環境下自聚合而得的貽貝仿生類材料，因其具備優良的近紅外光熱轉換功能而廣泛應用于腫瘤的光熱治療。盡管如此，光熱治療也存在一定局限性，單一的光熱治療并不能完全消融腫瘤，殘留的微小腫瘤會引起致命性的腫瘤復發和轉移。

細胞毒性自由基是一類能有效誘導癌細胞壞死或凋亡的活性物質[6]。其中，基于活性氧自由基的化學動力療法，已廣泛用于癌癥放療[7-8]、化療[9-10]和聲動力療法[11]。研究已經證明，化學動力療法利用過量的活性氧自由基可引起腫瘤細胞發生不可逆的損傷，進而顯著抑制腫瘤的生長。然而，腫瘤的低氧微環境在很大程度上降低了活性氧自由基的治療效果[12-13]。2,2-偶氮雙[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二鹽酸鹽(AIPH)是一種可在光照和加熱刺激下迅速解離釋放對細胞有毒性的烷基自由基的水溶性化合物[14]。由于不需要氧氣供應，基于AIPH的化學動力療法有望克服腫瘤的深層低氧微環境并實現腫瘤的完全消融[15-16]。基于上述分析，本研究擬將化學動力療法與光熱治療相結合，設計出負載AIPH的聚多巴胺納米顆粒(AIPH@PB NPs)用于乳腺癌細胞的治療。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器與細胞

血清白蛋白、多巴胺和AIPH均購自上海阿拉丁試劑公司；胎牛血清、DMEM和改良的RPMI培養基均購自美國Hyclone公司；冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)；808 nm激光器(北京鐳志威光電技術有限公司)；A560雙光束紫外可見分光光度計(上海翱藝儀器有限公司)；熱成像攝像機(東莞新泰儀器有限公司)；CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；酶標儀(美國伯樂公司)；小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)和小鼠乳腺癌細胞(4T1)均購自中科院上海細胞研究所。

1.2 制備AIPH@PB NPs

稱取20 mg血清白蛋白、2 mg AIPH和10 mg多巴胺，溶解于20 mL去離子水中，室溫下持續攪拌1 h，溶液從透明變為棕黑色。將棕黑色溶液于25 ℃ 2 000 r/min離心15 min；取上清液于透析袋中透析并經冷凍干燥機凍干，得到的棕黑色粉末即為AIPH@PB NPs。

1.3 表征AIPH@PB NPs的理化性質

利用馬爾文粒度分析儀表征其粒徑大小；利用X射線衍射能譜分析其晶體或非晶體結構；利用傅里葉紅外光譜表征其化學結構；利用X射線光電子能譜表征其元素組成。

1.4 檢測AIPH@PB NPs 的光熱效能

將AIPH@PB NPs 配成不同濃度(1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL)水溶液，先用紫外可見分光光度計檢測其在808 nm處光密度(D)值，然后以去離子水作為對照，用1.5 W/cm2功率密度的808 nm近紅外激光照射不同濃度AIPH@PB NPs水溶液10 min，觀察溫度變化。另外，在AIPH@PB NPs水溶液濃度為2.0 mg/mL時，觀察不同功率密度(1.0、1.5、2.0 W/cm2)下溫度的變化。每隔30 s記錄溫度變化的數值。并且根據其下降曲線(2.0 mg/mL，1.5 W/cm2)，計算其光熱轉換效率。為探究 AIPH@PB NPs的光熱再生性和穩定性，將2.0 mg/mL水溶液置于1.5 W/cm2的 808 nm 近紅外激光照射下進行4次加熱-冷卻循環。

1.5 紫外可見分光光度法檢測烷基自由基的產生

將0.1 mL AIPH@PB NPs(2.0 mg/mL)與0.1 mL 1,3二苯基異苯并呋喃(DPBF，1 mg/mL) 混合后在功率密度為 1.5 W/cm2的808 nm近紅外激光下照射不同時間，然后用紫外可見分光光度計檢測其在425 nm處D值。

1.6 CCK-8實驗檢測細胞活力

將1×104個小鼠胚胎成纖維細胞MEF和小鼠乳腺癌4T1細胞分別接種于96孔板中，在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h后，加入不同濃度的AIPH@PB NPs(0、10、25、50、100、200、400、800 μg/mL)孵育48 h；再加入CCK-8試劑并使用酶標儀測定細胞的相對存活率。另外，為了檢測光照下不同濃度AIPH@PB NPs對細胞活力的影響，將經過不同濃度AIPH@PB NPs孵育的細胞置于808 nm激光下照射5 min后繼續在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h，最后通過CCK-8法測定細胞活力。酶標儀測定在波長450 nm處各孔的D值，根據以下公式計算細胞活力：細胞活力(%)=(實驗組D值-空白組D值)/(對照組D值-空白組D值)×100 %，實驗獨立重復3次。其中實驗組加入細胞、AIPH@PB NPs和CCK-8溶液；空白組只加入CCK-8溶液；對照組加入細胞和CCK-8溶液。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 AIPH@PB NPs的合成及理化表征

AIPH@PB NPs的合成路徑見圖1A。馬爾文粒度分析儀結果(圖1B)顯示，制備的AIPH@PB NPs粒徑呈正態分布，約為165 nm。AIPH@PB NPs水溶液在室溫下分散均勻且無明顯沉淀。X射線衍射能譜圖表明，在20°處有較寬的衍射峰，代表AIPH@PB NPs為非晶相結構(圖1C)。利用傅里葉紅外光譜表征其化學結構(圖1D)，結果顯示在3 413 cm-1，1 602 cm-1和1 000 cm-1處出現3個很明顯的峰，分別對應C-OH、C=O和酰胺基團(-NHCO-)。此外，利用X射線光電子能譜表征AIPH@PB NPs的元素組成。由圖1E可以看出在287 eV、400 eV、532 eV和655 eV處顯示4個峰，表明AIPH@PB NPs由碳、氮、氧和錳等4種元素組成。

2.2 AIPH@PB NPs的光熱性能

利用紫外可見分光光度計檢測不同濃度的AIPH@PB NPs在808 nm處的D值，結果顯示，AIPH@PB NPs在808 nm處的D值呈現明顯的濃度依賴性(圖2A)。然后研究在1.5 W/cm2功率密度下不同濃度AIPH@PB NPs溶液的溫度變化。如圖2B顯示，溶液溫度隨著濃度的增加而升高，而對照組在同等照射條件下溫度無明顯變化。然后固定濃度2.0 mg/mL，研究不同功率密度下AIPH@PB NPs液的溫度變化。如圖2C所示，溶液溫度隨著功率密度的增加而升高。最后選取2.0 mg/mL AIPH@PB NPs在1.5 W/cm2下照射10 min得到如圖2D所示的光熱曲線圖，并根據其下降曲線獲得冷卻階段的時間與-Ln/θ的線性關系(圖2E)。根據公式計算出光熱轉換效率為31%。另外，利用激光開/關4個循環周期對AIPH@PB NPs的光熱穩定性進行研究。如圖2F所示AIPH@PB NPs在4個周期內光熱穩定性良好，光熱效果隨著光照次數的增加而保持穩定。以上實驗結果說明，AIPH@PB NPs具有良好的光熱轉換能力和光熱穩定性。

2.3 AIPH@PB NPs產生烷基自由基能力

自由基引發劑AIPH為熱敏性分子，可在加熱條件下分解生成具有較強活性的烷基自由基，而烷基自由基可在無氧條件下破壞多種細胞成分。本研究中，利用DPBF作為指示劑測量烷基自由基的產生。隨著照射時間的延長，溶液中425 nm處D值逐漸下降，說明不斷產生烷基自由基(圖3)。

A：AIPH@PB NPs的合成路線；B：AIPH@PB NPs的粒徑分布圖；C：AIPH@PB NPs的X射線衍射能譜圖；D：AIPH@PB NPs的傅里葉紅外光譜圖；E：AIPH@PB NPs的X射線光電子能譜圖

A：AIPH@PB NPs的紫外可見吸收光譜圖；B：AIPH@PB NPs在不同濃度下的光熱曲線圖；C：AIPH@PB NPs在不同功率密度下的光熱曲線圖；D：用1.5 W/cm2近紅外激光處理AIPH@PB NPs溶液600 s并冷卻下來的光熱曲線圖；E：從圖D冷卻階段獲得的時間與-Ln/θ的線性關系圖；F：AIPH@PB NPs溶液在4個輻照開/關周期下溫度變化圖

圖3 AIPH@PB NPs的紫外可見吸收光譜圖

2.4 AIPH@PB NPs的生物相容性和近紅外殺傷性能

如圖4A所示，在不同濃度的AIPH@PB NPs作用下MEF和4T1細胞均顯示出低毒性。即使在高濃度800 μg/mL下兩種細胞活力均高于80%。由此表明，AIPH@PB NPs在一定濃度范圍內具有很好的生物相容性。

如圖4B、4C所示，在相同近紅外光(1.5 W/cm2，5 min)照射下，與未添加AIPH@PB NPs的對照組相比，兩種細胞活力隨著AIPH@PB NPs濃度增加均逐漸遞減，其中4T1 細胞活力下降趨勢更加明顯，在800 μg/mL AIPH@PB NPs處理下，MEF細胞活力仍高于80%，而4T1細胞活力僅為15%。可能是由于腫瘤細胞對溫度變化更加敏感，所以其光熱殺傷效果和烷基自由基生成能力更加顯著。由此說明，制備的AIPH@PB NPs介導的光熱消融和烷基自由基生成可協同作用，達到有效殺傷腫瘤的效果。

A：MEF細胞和4T1細胞與不同濃度AIPH@PB NPs共培養后的細胞活力；B、C：經過808 nm近紅外光(1.5 W/cm2，5 min)照射后MEF細胞和4T1細胞活力。*：P<0.05，與0 μg/mL AIPH@PB NPs比較

3 討論

本文利用血清白蛋白、AIPH和多巴胺為底物，通過一步氧化法成功制備AIPH@PB NPs。其形態均一、粒徑適宜、生物相容性好，具有非晶體結構。同時，AIPH@PB NPs具備較高的光熱轉換效率和優越的光熱穩定性；可在808 nm近紅外激光照射下迅速升溫，并且隨著照射次數的增加光熱效果保持穩定。

更加重要的是由于正常細胞具有較好的熱耐受性，一定濃度范圍內的AIPH@PB NPs在近紅外激光照射下產生的熱量對正常細胞影響很小而可以直接殺傷乳腺癌細胞。由此可顯著降低光熱消融對正常組織的損傷，提高對乳腺癌細胞的特異性殺傷能力。此外，近紅外光激發產生的過高熱不僅可以直接殺傷乳腺癌細胞，還能促使AIPH裂解并釋放烷基自由基，進一步引起多種細胞成分的破壞，最終導致細胞凋亡。由此可見，AIPH@PB NPs介導的光熱消融和烷基自由基生成可協同作用，達到有效殺傷乳腺癌細胞的目的。

綜上所述，本研究制備的AIPH@PB NPs可以將化學動力療法與光熱療法結合在一起，具有優越的光熱轉換效能和高效的烷基自由基產生能力，在乳腺癌的治療領域具有一定的應用前景。