基于定量蛋白質組學的結直腸腫瘤脾氣虛證患者差異表達蛋白研究

柴仲秋，戴廣法，周 冰

（1.天津市濱海新區中醫醫院肛腸科，天津 300000；2.天津市濱海新區新港街社區衛生服務中心，天津 300000）

結直腸腫瘤（colorectal neoplasms）是世界范圍高發病率、高死亡率的消化道系統惡性腫瘤，其發病率居全球惡性腫瘤第3 位，死亡率居第2 位[1]。隨著研究的深入，目前已發現腫瘤細胞與基質微環境的相互作用對腫瘤的侵襲、轉移和預后影響重大[2]，而這一過程與中醫證候的整體觀念具有極大的相似性?！白C”是對致病因素與機體反應性的綜合情況，是對疾病當前本質所作的結論。近年來，針對結直腸腫瘤中醫證候本質的研究日益增多，但應用組織進行差異表達蛋白分析的研究相對較少。在辨證基礎上對腫瘤組織和正常組織的差異表達蛋白進行篩選可能對結直腸腫瘤的疾病發展、治療和轉歸提供新的研究方向。本研究在前期調查中發現脾氣虛證是結直腸腫瘤的常見證候之一[3]，因此以脾氣虛患者為研究對象開展相關研究，探索結直腸腫瘤脾氣虛證患者腫瘤組織與正常組織的差異表達蛋白，尋找該證型的中醫治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012 年8 月-2019 年8 月因結直腸腫瘤就診于天津市濱海新區中醫醫院行手術治療的患者作為研究對象。參照中華中醫藥學會中醫肛腸科常見病診療指南[4]、Dukes 分期及AJCC/UICC TNM 分期標準進行病情分期判定。參照證素診斷標準[3]，對每位患者的四診信息進行歸類整理和證候判定。證候診斷為脾氣虛證的患者共38 例，其中男21例，女17 例，年齡48～65 歲，平均年齡（55.16±13.15）歲；TNM 分期：Ⅰ期20 例、Ⅱ期11 例、Ⅲ期7 例，病理大體分型：隆起型6 例、潰瘍型8 例、隆起潰瘍型18 例、浸潤型6 例；病理類型腺癌31 例、黏液腺癌4 例、印戒細胞癌1 例、腺癌并印戒細胞癌2 例。

1.2 方法 手術切除腫瘤后分別取患者癌灶腸管組織及遠端正常腸管組織，各2 份，立即置液氮凍存。將樣本用液氮預冷的砸碎器砸碎，液氮研磨，提取蛋白同時進行分組標記（腫瘤組織標記為113，正常組織標記為114）。BSA 法定量檢測蛋白質水平；在高pH條件下進行反相色譜分離后的得到的組分采取夾心法上Loading Pump 以流速3 μl/min 進行分離。設置質譜參數后，進行質譜分析。根據蛋白的定量信息，選取上下調差異倍數≥1.4 的蛋白作為差異蛋白。

1.3 生物信息解析 將差異表達的蛋白輸入Uniprot數據庫進行功能和基因檢索，將對應基因保存為TXT 文件，輸入到Metascape，選擇選擇H.Sapiens，然后選擇Express Analysis，自動生成對差異表達蛋白進行的通路富集和分析結果。

2 結果

2.1 差異表達蛋白 脾氣虛證腫瘤組織與正常組織中差異蛋白總數為140 個，其中上調71 個，下調69個。進一步篩選上下調差異倍數≥1.6 倍的差異蛋白總數為42 個，其中上調蛋白20 個，見表1，下調蛋白22 個，見表2。

表1 脾氣虛證腫瘤組織與正常組織比較上調的蛋白

表2 脾氣虛證腫瘤組織與正常組織比較下調的蛋白

表2 （續）

2.2 差異表達蛋白分析 應用Metascape 對上下調差異倍數≥1.4 倍的140 個差異蛋白進行通路富集，其中排名前20 的通路見表3 和圖1；主要生物過程見圖2，主要集中在平滑肌收縮、氣體運輸、粒細胞激活、Nop56p-associated pre-rRNA 復合體、血管平滑肌收縮、防御反應的積極調節、RNA 代謝等。

圖1 差異表達蛋白的通路富集（TOP 20）

圖2 差異表達蛋白的主要生物過程

表3 差異表達蛋白的通路富集

3 討論

近年來，整體觀念指導下的中醫辨證論治逐漸成為結直腸癌治療方案中不可忽視的一環，其積極作用也日益顯現。然而由于缺乏客觀、穩定的診斷及療效評價指標，中醫證候的辨識模糊且不穩定。辨證論治是中醫臨床醫學的精髓，證候是中醫立法處方的依據。因此，在整個中醫藥理論體系的框架內，中醫的證候問題始終處于核心的地位，它是連接臨床和基礎理論的橋梁，也是中醫藥理論現代化能夠取得突破的關鍵點。近年來眾多學者開展了結直腸癌中醫證候規范化及證候間差異表達因子的研究，為結直腸癌中醫證候客觀化奠定了基礎，提供了有益的研究方向。

王洪琦等[5]采用免疫組化法、ELISA 法和RTPCR 法對腫瘤組織中HSP70 和P53 進行比較，發現結腸癌熱證組、熱證合計組HSP70、P53 的陽性率均明顯高于各非熱證組。杜國亮等[6]采用免疫組化法對腫瘤組織蛋白P21WAF1 和p21H-ras 進行分析，發現虛證組p21WAFl 陽性表達水平顯著低于實證及虛實夾雜證組。吳蘇冬等[7]應用免疫組化法對腫瘤組織蛋白p53、Bcl-2 和Bax 進行分析發現，脾虛組患者p53，Bcl-2 蛋白的陽性表達率及表達水平顯著高于非脾虛組。羅明等[8]采用免疫組化法對腫瘤組織CD44v6 及PCNA 進行分析，發現有淋巴結轉移或全身多處轉移結直腸癌患者，實證較虛證CD44v6 的表達明顯增高。周小軍等[9-11]采用通過雙向凝膠電泳的方法對腫瘤組織進行蛋白質組學分析，同時聯用質譜鑒定和生物信息學分析發現濕熱蘊結證、氣血虧虛證結直腸癌患者腫瘤組織之間，以及兩組患者與正常人結腸黏膜組織間的差異蛋白質主要為熱休克蛋白（HSP）、細胞骨架蛋白、抗氧化蛋白、信號轉導相關蛋白、能量產生相關蛋白、血液蛋白等。趙海燕等[12]同樣通過雙向凝膠電泳對腫瘤組織進行蛋白質組學分析，并聯合質譜鑒定和生物信息學分析發現血瘀組較健康組和氣血虧虛組的IL-8、維生素D 結合蛋白前體、β-GDP 解離抑制因子、α-二酯酰甘油激酶表達均上調，而纖維結合蛋白（FN）均下調；同時，血瘀組較健康組上調而較氣血虧虛組下調的為腫瘤基因DJ-1、載脂蛋白A-I 前體、軟骨關聯性蛋白前體；血瘀組較健康組下調、而較氣血虧虛組上調的為ADP 核糖基化類蛋白15、血清淀粉樣蛋白A。龔秀麗等[13]通過免疫組化方法對虛實兩組證候的正常組織、癌旁組織和腫瘤組織檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、成纖維細胞激活蛋白（FAP）、成纖維細胞特異蛋白（S1O0A6）、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）、平足蛋白podoplanin（PDPN）的表達，發現中醫虛實兩組的癌組織、癌旁組織和正常組織中上述活化成纖維細胞標記物表達差異不明顯。洪朝金等[14]采用人全基因組芯片檢測大腸癌組織差異表達基因，篩選并分析陰虛證癌組織組和癌周正常組織組的差異表達基因，并利用Pathway 對相關基因進行生物信息學分析。結果發現大腸癌圍手術期患者陰虛證癌組織組和癌周正常組織組表達的差異基因共4869 個，包括上調基因1574 個，下調基因3295 個，主要涉及炎癥反應、細胞內吞功能、礦物質吸收、酮體合成與分解功能、免疫功能等相關基因，其主要信號轉導通路包括MAPK 信號通路及p53 信號通路等。白玉茹[15]的研究為探尋脾虛濕盛型大腸癌的客觀依據，其選取23 例經病理確診的脾虛濕盛型大腸癌患者的組織進行iTRAQ 定量蛋白鑒定并進行生信分析和WB驗證。結果顯示MGST2、RRM2、SRM、GSTT1、GPX3、GSTM3 6 個差異蛋白經WB 驗證與iTRAQ結果一致，為脾虛濕盛型大腸癌的發生發展機制及相關腫瘤標志物的研究提供了新的線索。季青等[16]的研究顯示，肝腎陰虛證和無證可辨的大腸癌、肝癌患者的血漿蛋白中共同的差異蛋白有8 個，主要與補體和凝血級聯途徑有緊密聯系，認為KNG1、HBA2 等蛋白可能是大腸癌和肝癌“異病同證”的物質基礎之一。

本研究發現，脾氣虛證結直腸腫瘤組織與正常組織中差異表達蛋白的通路主要集中在平滑肌收縮、氣體運輸、粒細胞激活、Nop56p-associated prerRNA 復合體、血管平滑肌收縮、防御反應的積極調節、RNA 代謝、Vesicle-mediated 轉運、Wnt 信號通路、平面細胞極性通路、DNA 代謝過程的負調控、核導入、突觸傳遞的正調控、線粒體組織、中間絲狀細胞骨架組織、膠原蛋白生物合成過程、鋅離子反應、調節白細胞介素-12 的產生、細胞生長、生長因子受體和第二信使信號轉導疾病、通過受體酪氨酸激酶信號傳導等中。蛋白組學技術在傳統中醫藥研究中的應用[17]是現有研究手段中的熱點，但由于蛋白組技術的復雜程度更高，涉及到復雜的分離、擴增、純化和翻譯后修飾，因此迫切依托高通量、高靈敏度、高準確性的研究技術平臺來開展高水平研究。但隨著蛋白芯片、雙向電泳、蛋白質譜等技術的不斷成熟與使用，蛋白組學技術將在闡明中醫藥防治大腸癌機制上發揮重要作用。除蛋白組學外，研究者還嘗試應用代謝組學[18-20]、網絡生物學[21]、系統生物學[22，23]、表觀遺傳學[24]以及基因多態性[25]等方法來嘗試研究中醫證候本質，為該領域研究的深入提供了更多的研究方向。

綜上所述，脾氣虛證結直腸腫瘤患者腫瘤組織與正常組織間的蛋白表達存在差異，其差異蛋白的生物過程主要集中在平滑肌收縮、氣體運輸、粒細胞激活等通路中，這些通路對脾氣虛證的結直腸腫瘤的形成具有重要影響。