大黃、赤芍注射液對急性肝衰竭模型大鼠肝功能、肝再生指標的影響及機制研究

張榮臻，呂 超，王 娜，陳月橋，毛德文

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院,廣西 南寧 530023)

急性肝衰竭(Acute liver failure，ALF)是由肝細胞大量死亡造成肝功能嚴重障礙，并在2周內出現Ⅱ度以上肝性腦病的臨床綜合征，可出現肝功能異常、黃疸、肝臟生化指標異常、凝血功能障礙等， 28 d內病死率超過50%[1-2]。其病因多種多樣，藥物(通常是對乙酰氨基酚)、化學毒素、病毒感染、酒精、代謝等均可導致ALF，肝切除和肝移植等肝臟手術后由于肝臟沒有足夠容量來維持肝再生也會引起ALF[3]。肝移植是治療ALF的有效手段，因此了解肝細胞再生的病理生理機制對于治療ALF有著重大的臨床意義。既往研究[4]發現，大黃、赤芍可以改善肝衰竭大鼠肝功能，提高大鼠生存率，其作用機制可能與促進肝細胞再生相關。因此，觀察大黃、赤芍注射液對ALF模型大鼠肝功能及肝再生指標的影響，并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF級SD雄性大鼠120只，鼠齡2個月，體重190～240 g,由湖南長沙市天勤生物技術有限公司提供(動物生產許可證號：SCXK湘2014-0011)。飼養和實驗均在廣西中醫藥大學第一附屬醫院實驗中心完成。動物飼養環境遵循實驗中心條件，溫度控制在24 ℃左右，光照時間按照12 h間隔，保持充足飼料和飲水，定期清理排泄物。

1.1.2 大黃注射液：取大黃(購自廣西仙茱中藥科技有限公司)粉末1 kg，70%乙醇12倍量，提取2次，每次30 min。抽濾后合并濾液，回收乙醇并濃縮至無醇味，加入95%乙醇至含醇度80%，靜置24 h，抽濾。濾液以20% NaOH調節pH至8，冷藏24 h，濾過。濾液以10% HCl調節pH至5～6，回收乙醇至無醇味，得到大黃提取物。補加注射用水至100 ml，冷藏24 h，G3過濾后灌封、消毒。

1.1.3 赤芍注射液：取赤芍(購自廣西仙茱中藥科技有限公司)粉末1 kg，60%乙醇12倍量，提取30 min。抽濾后合并濾液，回收乙醇并濃縮至2000 ml。加入5%明膠250 ml，充分攪拌后靜置24 h，抽濾。濾液加入95%乙醇至含醇度70%左右，靜置24 h，抽濾。濾液回收乙醇并濃縮至1000 ml，濃縮液加入95%乙醇至含醇度85%，靜置24 h，抽濾。回收乙醇至無醇味，補加注射用水至1000 ml，冷藏24 h，G3精濾后灌封、消毒。

1.1.4 其他試劑：促肝細胞生長素注射液(吉林敖東藥業)，戊巴比妥鈉注射液(北京華業寰宇化工有限公司)，Jak2(D2E12)XP?兔單克隆抗體(CST)，Phospho-Stat3(Tyr705)(D3A7) XP?兔單克隆抗體(CST)，兔抗-IL-6抗體(博奧森)，兔抗PCNA 抗體(bs-2006R)(博奧森)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備與分組：根據前期研究成果[5]構建ALF大鼠模型后，選取100只隨機分為造模陽性對照組(對照組)，促肝細胞生長素組(生長素組)，大黃、赤芍低劑量組(低劑量組)，大黃、赤芍中劑量組(中劑量組)，大黃、赤芍高劑量組(高劑量組)，每組20只。

1.2.2 給藥方法：參照文獻[6]研究方法，以成人用藥劑量為基礎，按照相對體表面積換算。臨床上大黃、赤芍成人每日給藥量為15 g生藥/60 kg，換算出大鼠對應給藥量為1.46 g生藥/kg，對應注射液靜脈給藥量為每日0.5 ml/100 g。實驗前3 d至結束分別于尾靜脈注射給藥，1次/d，間隔24 h。低劑量組每日給予0.25 ml/100 g，中劑量組每日給予0.5 ml/100 g，高劑量組每日給予0.75 ml/100 g，對照組每日給予0.9%氯化鈉溶液1 ml/100 g，生長素組參照文獻每日給予促肝細胞生長素1 ml/100 g。實驗中動物均飲用生理葡萄糖鹽水(內含10%葡萄糖和0.9%氯化鈉)。

1.2.3 標本采集：分別于造模后24、48 h從五組大鼠中隨機各取6只采集相關組織樣本。具體操作如下：①大鼠經1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定在手術臺上，碘伏消毒后鋪無菌孔巾。正中腹部切開，腹主動脈抽取EDTA抗凝血2 ml，3000 r/min離心5 min后收集血清及血漿各1管分裝，-80 ℃保存，避免反復凍融。②抽血后剖取肝組織并快速放入PBS 中洗凈，濾紙吸干，稱重后10%甲醛液固定，將約100 mg肝組織裝入凍存管放于液氮罐中凍存，約100 mg分裝至RNAlater保存液EP管中，4 ℃冰箱保存過夜后轉至-80 ℃超低溫冰箱。

1.3 觀察指標 比較造模后24、48 h各組大鼠血清肝功能指標[天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)及總膽紅素(TBIL)]及肝再生指標[有絲分裂指數(MI)、增殖指數(PI)以及增殖細胞核抗原(PCNA)]。

1.3.1 MI檢測：將10%甲醛固定的肝組織標本進行梯度酒精脫水后包埋切片(5 μm)，再次使用常規酒精脫水、沖洗，進行蘇木素和伊紅染色，中性樹膠封片后在光學顯微鏡下觀察1000個肝細胞中有絲分裂細胞數目情況。MI=有絲分裂細胞數/1000×100%。

1.3.2 PI檢測：大鼠采血后取下肝組織，剪下約黃豆大小的肝臟放入35 mm培養皿中，加入1640培養基2 ml，在培養皿中將肝臟輕輕研磨成細胞懸液。用巴氏吸管吸取研磨后的懸液，經200目尼龍膜過濾至15 ml離心管中，加1640培養基至10 ml， 2000 r/min離心10 min后棄上清，加入預冷的75%乙醇10 ml快速混勻，4 ℃過夜。2000 r/min離心10 min后棄上清，加入PBS 10 ml。上述步驟重復2遍，加入PI/Rnase 500 μl，4 ℃避光孵育30 min后過濾至流式管，上機收集PI通道熒光數據，導出fcs文件，通過modfit擬合分析細胞在各個時期的百分比。

1.3.3 PCNA檢測：將包埋好的肝組織標本切片脫蠟，依次常規酒精脫水、沖洗，抗原修復，封閉，孵育一抗，孵育二抗，DAB顯色，復染，脫水，封片鏡檢，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察染色情況。染色后如果鏡下觀察細胞核顯棕褐色，則為PCNA陽性。隨機選取10個視野，每個視野觀察100個細胞，總計觀察1000個細胞，記錄PCNA細胞陽性數量。

2 結 果

2.1 五組大鼠一般情況 五組大鼠在造模4～6 h后蘇醒，表現出精神萎靡、行動遲緩、嗜睡等癥狀。12 h內只有對照組中1只大鼠死亡，其他組無死亡大鼠。藥物干預組大鼠總體表現較對照組好。中劑量與高劑量組大鼠有腹瀉現象，可能與大黃、赤芍劑量有關。

2.2 五組大鼠造模后24、48 h血清肝功能指標比較 見表1。造模后24 h，對照組ALT、AST、TBIL水平明顯高于其他四組(均P<0.05)。造模后48 h，五組大鼠各指標水平均有所下降，對照組ALT、AST、TBIL水平仍明顯高于其他四組(均P<0.05)。各藥物干預組中，以低劑量組與生長素組肝功能指標降低最為明顯，但組間比較無統計學差異(均P>0.05)。

表1 五組大鼠造模后24、48 h血清肝功能指標比較

2.3 五組大鼠造模后24、48 h MI和PI比較 見表2(圖1)。造模后24、48 h，對照組MI明顯低于其他四組，生長素組與低劑量組MI明顯高于中、高劑量組(均P<0.05)。造模后24 h對照組PI低于其他四組，生長素組與低劑量組PI高于中、高劑量組(均P<0.05)。造模后48 h相比24 h各組PI均有一定提高，對照組PI仍低于其他四組(均P<0.05)，但其他四組間PI比較無統計學差異(均P>0.05)。

圖1 五組大鼠造模后24、48 h肝組織HE染色結果(×40)

表2 五組大鼠造模后24、48 h MI和PI比較(%)

2.4 五組大鼠造模后24、48 h PCNA陽性細胞數比較 見表3(圖2)。造模后24、48 h，低劑量組、高劑量組和生長素組PCNA陽性細胞數均高于對照組(均P<0.05)。

圖2 五組大鼠造模后24、48 h肝組織免疫組化染色結果(×40)

表3 五組大鼠造模后24、48 h PCNA陽性細胞數比較(個)

3 討 論

內科綜合治療、人工肝支持及肝移植是治療ALF的常規方法。肝移植手術為目前終末期肝病治療的唯一有效手段，其通常是在期望立即且充分的肝再生情況下進行的[7]。但是，如果沒有發生肝再生，則會導致嚴重的肝衰竭和一般情況惡化，從而影響預后。因此，了解肝再生的生理病理特征對于疾病的治療轉歸和預后無疑很重要，研究控制肝再生機制對于治療肝衰竭、肝切除術及肝移植手術有著重大的臨床意義，可有效減輕患者的病死率，提高其生存率及生存質量。肝再生可分為三個階段，即啟動期、增殖期和終止期。肝再生是一個復雜而精密的過程，與生長因子、氧化應激、免疫調節、炎癥反應等密切相關[8-11]，其中涉及的多種因子及信號傳導機制尚未明確，也需要醫療界不斷深入探索、發現。

大黃具有多種作用，幾乎可作用于肝衰竭發病的各個環節，是治療肝衰竭的首選藥[12]。當代肝病醫家汪承伯教授重用赤芍治療肝衰竭，也取得了良好療效[13]。課題組在前期研究中發現大黃、赤芍注射液能夠上調肝衰竭大鼠血清白細胞介素(IL)-6水平，活化JAK/STAT信號通路，改善肝衰竭大鼠的生存率[14-15]。大黃、赤芍可以提高大鼠肝組織中PCNA水平，促進血清中IL-6水平上升，提高術后大鼠存活率，促進肝細胞再生[4，16]。現代藥理學研究表明，大黃的主要有效成分為蒽醌衍生物，其治療ALF的主要作用機制包括增強淋巴細胞免疫功能、促進膽汁排放以及一定的抗感染作用等。赤芍中含有大量單萜苷，赤芍總苷是其主要有效成分[17]。芍藥苷可通過降低肝組織丙二醛、活性氧、一氧化氮、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(還原型)氧化酶4的量及增加谷胱甘肽的量而避免肝氧化損傷[18]。

本研究顯示，對照組大鼠精神萎靡、行動遲緩，藥物干預組大鼠總體表現較對照組好。另外，造模后24、48 h，對照組ALT、AST、TBIL水平明顯高于其他四組；對照組MI和PI均低于其他四組，生長素組與低劑量組高于中劑量組與高劑量組；低劑量組、高劑量組和生長素組PCNA陽性細胞數均高于對照組。這些結果表明干預藥物均能夠促進肝細胞活化和增殖，且以低劑量組與生長素組效果最佳。

綜上所述，大黃、赤芍注射液可有效促進肝細胞增殖再生，提高大鼠存活率，其機制可能與提高大鼠肝細胞MI、PI、PCNA水平，促進肝細胞再生有關。前期研究[19]發現大黃、赤芍能夠調控ALF大鼠血清IL-6水平，調節活化的JAK/STAT信號通路，改善肝衰竭大鼠生存率。由于IL-6/JAK/STAT3通路在肝切除術后對調節肝細胞增殖和生長起著關鍵作用，有助于穩定肝再生進程，促進肝細胞再生，而且補償了必要的肝功能[20]。大黃、赤芍是否可以通過IL-6/JAK/STAT通路調控肝細胞再生從而提高ALF治愈率，有待進一步的研究。