外泌體微小RNA-23a對非小細胞肺癌血管生成的影響及機制研究

崔 凱，白峻峰，支亞男，姜 琨，王壯壯，公孫鑫

(西安國際醫學中心醫院胸腔外科，陜西 西安 710100)

肺癌細胞的生長、浸潤及轉移受缺氧和腫瘤血管兩個重要因素的調控[1-3]。血管內皮生長因子(VEGF)在肺癌等多種惡性腫瘤組織中異常表達[4-5]，而miRNA參與了腫瘤血管生成的調節[6]。研究[7-9]表明，miR-23a通過外泌體的轉移參與調控鼻咽癌相關的血管生成，進而促進轉移；第10號染色體缺失性磷酸酶和張力蛋白同源物基因(PTEN)通過抑制下游磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號轉導通路發揮抗腫瘤作用。目前肺癌組織中VEGF異常表達介導腫瘤血管生成的機制尚不明確。本研究擬探究外泌體miR-23a對NSCLC血管生成的影響，并分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 H1299細胞購自中科院上海細胞庫；酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自英國Abcam公司；實時定量反轉錄PCR(qRT-PCR)試劑盒購自Takara公司；PTEN(No.9863464)、AKT(No.7645465)、磷酸化AKT(p-AKT，No.9863464)、VEGF(No.6754365)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(No.6545324)購自Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化染色：對NSCLC患者癌組織及癌旁組織樣本進行石蠟包埋、切片后脫蠟和水化。3% H2O2和0.01 mol/L枸櫞酸鈉鹽溶液進行抗原修復。5% BSA封閉液室溫封閉1 h，PTEN和VEGF一抗4 ℃孵育過夜。次日加二抗室溫孵育，中性樹膠封片[8]。

1.2.2 細胞培養及轉染：完全培養液培養H1299細胞，6×105個細胞接種于6孔板。細胞轉染陰性對照RNA(對照組)、miR-23a mimic(miR-23a mimic組)和miR-23a inhibitor(miR-23a inhibitor組) 8 h后換新鮮完全培養基于37 ℃、5% CO2條件下孵箱培養，分別于24、48 h后收集細胞及其上清。

1.2.3 ELISA實驗：收集轉染后細胞上清，采用ELISA試劑盒檢測miR-23a過表達或抑制后H1299細胞中PTEN和VEGF的表達水平。

1.2.4 qRT-PCR檢測RNA表達：TRIzol提取總RNA反轉錄獲得總cDNA，反應嚴格按照Takara公司2×SYBR Premix Ex Taq II試劑盒進行操作。基因相對表達量根據2-ΔΔCT計算。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達：在NSCLC患者癌組織及癌旁組織中加入RIPA裂解液提取總蛋白，隨后加緩沖液，100 ℃煮5 min。緊接著進行SDS-PACE電泳分離蛋白，蛋白轉膜至PVD膜，轉膜條帶脫脂牛奶封閉，清洗后孵育一抗(本研究所有抗體比例1∶1000)，4 ℃冰箱過夜。次日孵育二抗，PBST緩沖液清洗，ECL化學發光檢測蛋白表達。

2 結 果

2.1 癌組織與癌旁組織PTEN、VEGF表達比較 見圖1。免疫組化結果顯示，NSCLC患者癌組織中PTEN陽性表達明顯低于癌旁組織，而VEGF的陽性表達明顯高于癌旁組織(均P<0.05)。

注：左圖為癌組織與癌旁組織免疫組化染色結果(標尺=200 nm)；右圖中，與癌旁組織比較，*P<0.01

2.2 miR-23a過表達和敲減細胞系構建情況 見圖2。與對照組相比，miR-23a mimic轉染H1299細胞后miR-23a表達上調，轉染miR-23a inhibitor以后miR-23a表達下降(均P<0.05)，表明miR-23a過表達和敲減細胞系構建成功。

2.3 三組細胞PTEN和VEGF表達水平比較 見表2。ELISA結果顯示，miR-23a過表達明顯抑制H1299細胞PTEN表達，增強VEGF表達，而抑制miR-23a后結果相反(均P<0.05)。

表2 三組細胞PTEN和VEGF表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.01

2.4 miR-23a對PTEN、AKT和VEGF mRNA表達的影響 見圖3。qRT-PCR結果顯示，miR-23a過表達明顯抑制H1299細胞PTEN mRNA表達，促進AKT和VEGF mRNA表達；抑制miR-23a可上調PTEN mRNA表達，抑制AKT和VEGF mRNA表達(均P<0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.01

2.5 miR-23a對PTEN、AKT、p-AKT和VEGF蛋白表達的影響 見圖4。Western blot結果顯示，miR-23a過表達明顯抑制H1299細胞PTEN蛋白表達，促進p-AKT和VEGF蛋白表達；抑制miR-23a可上調PTEN蛋白表達，抑制p-AKT和VEGF蛋白表達(均P<0.05)。

注：左圖為各蛋白電泳圖；右圖中，與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

3 討 論

2018年全球癌癥統計數據顯示肺癌位居癌癥發病率和病死率首位[10]。目前，手術治療仍然是NSCLC的唯一治療方法，但患者術后生存率仍未明顯改善。近年來，外泌體已經成為治療多種疾病的有效藥物和基因治療轉運體。外泌體是一類直徑20～100 nm的細胞來源囊泡，能夠影響血管生成、轉移和其他生物細胞與腫瘤發生相關的屬性表皮生長因子受體[11-12]。研究[13]發現，癌癥細胞衍生的微環境能夠通過外泌體miRNA促進NSCLC發生與發展，為揭示腫瘤發生機制和潛在新治療靶點提供了理論依據。此外，遺傳和表觀遺傳異常如miRNA和基因譜變化，已涉及多種惡性腫瘤發生。miRNAs是一類長度約19～25個核苷酸的非編碼RNA小分子，在NSCLC中表達異常，其中部分與NSCLC的進展和預后有關[14]。

miRNA是基因表達的重要介質，通過與蛋白編碼基因mRNA配對來引導其抑制。此外，miRNA參與調控炎癥、細胞周期進展、應激反應、細胞分化和凋亡等細胞過程[15]。有研究[16-17]報道，miRNA通過調節胃癌細胞中癌基因或抑癌基因表達而影響胃癌的發生；miRNA在介導乳腺癌干細胞和膀胱癌上皮細胞-間充質細胞轉換中發揮了關鍵作用。研究[18]發現，miR-23a/b可通過靶向PDCD4抑制前列腺癌細胞凋亡，進而促進腫瘤發生與發展，提示miR-23a/b具有致瘤作用。另外，miR-23a下調已被證明能夠負調控腫瘤抑制因子和PTEN，而PTEN缺失又促進了肝癌細胞增殖及轉移[19]。因此，我們推測外泌體miR-23a可能通過靶向PTEN參與NSCLC的發生。

NSCLC細胞來源的miRNA在腫瘤發生和轉移過程中具有重要意義[20]。miRNAs在惡性腫瘤發生與發展過程中起重要的促進或抑制作用[21]。本研究中，PTEN在NSCLC患者癌組織中表達較癌旁組織明顯降低，證實PTEN是miR-23a的靶點。PTEN被報道在多種惡性腫瘤中發揮重要的抑癌作用，其高表達能夠顯著抑制結直腸癌細胞增殖，降低細胞存活率[22]。PTEN缺失能夠誘導宮頸癌的發生和發展[23]。此外，PTEN可被miR-718和miR-382協同靶向，進而抑制乳腺癌的血管生成和進展。因此，miR-23a可能通過負調控PTEN促進NSCLC血管生成和進展。

本研究發現，肺癌組織PTEN表達低于癌旁組織，而VEGF表達高于癌旁組織；miR-23a過表達明顯抑制H1299細胞PTEN mRNA和蛋白表達，促進AKT、VEGF mRNA以及p-AKT和VEGF蛋白表達，而抑制miR-23a后結果相反。上述研究結果提示外泌體miR-23a可能通過靶向抑制PTEN促進VEGF表達，誘導NSCLC腫瘤血管生成，激活肺癌細胞的異常增殖和遠端侵襲轉移能力。

綜上所述，NSCLC細胞來源的外泌體miR-23a能夠誘導腫瘤血管生成，促進NSCLC的發展，其機制可能與靶向抑制PTEN有關。因此，靶向miR-23a有望為臨床抗NSCLC治療提供新思路和靶點。