急性髓細(xì)胞白血病模型小鼠B細(xì)胞易位基因1和Ikaros家族鋅指轉(zhuǎn)錄因子1表達(dá)水平及相關(guān)性分析

姚 玉，靳娟娟，LUGMAR(哈薩克斯坦)

(1.銅川市人民醫(yī)院血液科，陜西 銅川 727100；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046)

急性髓細(xì)胞白血病(Acute myeloid leukemia，AML)為主要的白血病類型之一，也是成人常見的惡性腫瘤疾病之一[1-2]。由于該病患者伴隨有骨髓造血干/祖細(xì)胞分化障礙，使得積聚的白血病細(xì)胞抑制骨髓正常造血功能并可發(fā)展轉(zhuǎn)移與浸潤，導(dǎo)致病死率一直居高不下[3]。AML患者不僅病死率高，存活者具有很高的復(fù)發(fā)率，而且起病急，給臨床治療帶來了極大的困難。小鼠是白血病研究的理想動(dòng)物模型，目前非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠已經(jīng)廣泛應(yīng)用于構(gòu)建白血病模型，成為研究AML發(fā)病機(jī)制的重要模型之一[4-5]。隨著對惡性腫瘤發(fā)病原因的不斷深入研究，AML發(fā)病機(jī)制逐漸被認(rèn)識，靶向治療在臨床治療中也取得了顯著的療效，但是仍需要尋找新的分子靶點(diǎn)[6-7]。Ikaros家族鋅指轉(zhuǎn)錄因子1(Ikaros family zinc finger 1，IKZF1)的編碼蛋白Ikaros是血液淋巴系統(tǒng)發(fā)育必需的轉(zhuǎn)錄因子，屬于鋅指DNA結(jié)合蛋白家族，可通過參與染色質(zhì)重塑調(diào)控淋巴細(xì)胞分化發(fā)育[8]。B細(xì)胞易位基因1(B cell translocation gene 1，BTG1)蛋白是一種ATP依賴性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，為一種腫瘤抑制因子，可抑制白血病細(xì)胞的增殖，其高表達(dá)能提高白血病患者的生存率[9-10]。本研究檢測AML小鼠模型腫瘤抑制因子IKZF1和BTG1表達(dá)情況并進(jìn)行了相關(guān)性分析，希望為闡明AML發(fā)生機(jī)制提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇雄性SPF級NOD/SCID小鼠36只，周齡3周，體重10 g，購于上海賽默科技生物發(fā)展有限公司(生產(chǎn)許可證號：20208482881)。本實(shí)驗(yàn)得到了本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，嚴(yán)格按照動(dòng)物倫理學(xué)操作，實(shí)驗(yàn)操作前進(jìn)行適應(yīng)飼養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑 AML細(xì)胞系HL60細(xì)胞保存于本實(shí)驗(yàn)室；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Hyclone公司；抗BTG1抗體(批號：K11169-IJC，工作濃度1∶500)購自北京百奧萊博科技有限公司；抗IKZF1抗體(批號：MAB11150，工作濃度1∶200)購自美國Abnova公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物準(zhǔn)備 HL60細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM液中，在含5% CO2、37 ℃恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)達(dá)到對數(shù)生長平臺期后進(jìn)行傳代。NOD/SCID小鼠飲用酸化水(pH 4.5)，以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，1周添加雞蛋喂養(yǎng)2次，室內(nèi)空氣經(jīng)中效過濾，所有小鼠喂養(yǎng)與接觸的物品均嚴(yán)格滅菌，定期更換飼料、墊料及滅菌水。

1.4 AML小鼠模型制備 收集對數(shù)生長期HL60細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5 min，取下層細(xì)胞，清洗3次后用無血清培養(yǎng)液調(diào)整密度至2.5×107/ml和5.0×107/ml。將36只小鼠隨機(jī)等分為模型A組、模型B組和對照組，前兩組依次經(jīng)尾靜脈注射HL60細(xì)胞1×107/只、5×106/只，對照組注射0.9%氯化鈉溶液，每只注射劑量為0.2 ml。

1.5 觀察指標(biāo) ①觀察小鼠的一般情況，包括食欲、體重、活動(dòng)能力、精神、毛發(fā)等。②在接種第7、14、28天取小鼠尾靜脈血，利用血細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞、血小板等指標(biāo)。③取上述血液樣本，加入抗人CD33-FITC抗體20 μl，加入紅細(xì)胞裂解液1 ml，避光孵育30 min，PBS懸浮，采用流式細(xì)胞儀檢測白細(xì)胞CD33表達(dá)水平。④在接種第28天處死所有小鼠，反復(fù)沖洗骨髓腔，提取總蛋白，采用Western blot法檢測BTG1和IKZF1蛋白相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 模型組小鼠一般情況 模型A組和模型B組小鼠成瘤率100.0%，出現(xiàn)精神狀態(tài)差、行動(dòng)遲緩、進(jìn)食減少、活動(dòng)減少、嗜睡、步態(tài)不穩(wěn)、體重下降等情況。

2.2 三組模型小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重比較 見表1。模型A組和模型B組小鼠在接種第7、14、28天體重均低于對照組(均P<0.05)。模型A組和模型B組小鼠體重比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 三組模型小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重比較(g)

2.3 三組模型小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血指標(biāo)比較 見表2。模型A組和模型B組小鼠在接種第7、14、28天紅細(xì)胞均高于對照組，血小板均低于對照組(均P<0.05)。模型A組與模型B組小鼠外周血紅細(xì)胞、血小板比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

表2 三組模型小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血指標(biāo)比較

2.4 三組模型小鼠白細(xì)胞CD33陽性率比較 見表3。模型A組和模型B組小鼠接種第28天白細(xì)胞CD33陽性率均高于對照組(均P<0.05)。模型A組與模型B組白細(xì)胞CD33陽性率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表3 三組模型小鼠白細(xì)胞CD33陽性率比較(%)

2.5 三組模型小鼠BTG1和IKZF1蛋白相對表達(dá)水平比較 見表4。模型A組和模型B組接種第28天骨髓BTG1和IKZF1蛋白相對表達(dá)水平均低于對照組(均P<0.05)。模型A組與模型B組小鼠BTG1和IKZF1蛋白相對表達(dá)水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

表4 三組模型小鼠BTG1和IKZF蛋白相對表達(dá)水平比較

2.6 BTG1和IKZF1蛋白相對表達(dá)水平與其他指標(biāo)相關(guān)性分析 見表5。在模型組中，Pearson相關(guān)性分析顯示，BTG1和IKZF1蛋白相對表達(dá)水平與CD33陽性率、體重、紅細(xì)胞、血小板都存在相關(guān)性(均P<0.05)。

表5 BTG1和IKZF1蛋白相對表達(dá)水平與其他指標(biāo)相關(guān)性

3 討 論

AML是因髓系前體細(xì)胞基因受損而導(dǎo)致的血液性腫瘤性疾病，多數(shù)患者伴隨有細(xì)胞遺傳學(xué)異常。該病的自然病程僅為數(shù)周到數(shù)月，具有很高的病死率[11]。該病發(fā)生機(jī)制還不明確，遺傳學(xué)異常不僅導(dǎo)致AML發(fā)病，也關(guān)系到疾病的進(jìn)展與預(yù)后。NOD/SCID小鼠保留了脊髓損傷小鼠T、B淋巴細(xì)胞缺陷的特點(diǎn)，同時(shí)還具有無循環(huán)補(bǔ)體、巨噬細(xì)胞功能損害、滲漏現(xiàn)象少、不能發(fā)生自發(fā)免疫性糖尿病、NK細(xì)胞活性低等特點(diǎn)，是AML實(shí)驗(yàn)研究的理想模型[12]。本研究顯示，模型A組和模型B組小鼠在接種第7、14、28天的體重、血小板均低于對照組，紅細(xì)胞高于對照組，且模型A組與模型B組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明建模成功。

AML是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，具有幼稚細(xì)胞失去分化能力、各種異常細(xì)胞免于被機(jī)體清除、細(xì)胞不受控制地增殖等特點(diǎn)[13-14]。本研究顯示，模型A組和模型B組小鼠接種第28天白細(xì)胞CD33陽性率高于對照組，但模型A組與模型B組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。白細(xì)胞CD33陽性率升高，表明白血病細(xì)胞的凋亡能力降低，多伴有浸潤，可促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖，導(dǎo)致疾病惡化[15-16]。

本研究顯示，模型A組和模型B組接種第28天骨髓BTG1和IKZF1蛋白相對表達(dá)水平低于對照組，但模型A組與模型B組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從機(jī)制上分析，IKZF1基因含8個(gè)外顯子，其表達(dá)的蛋白包含結(jié)合DNA的N端4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，并且C端具有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，鋅指結(jié)構(gòu)與DNA正確結(jié)合才能正常發(fā)揮功能[17-18]。抑制IKZF1的表達(dá)可以通過抑制脯氨酰羥化酶導(dǎo)致氧化誘導(dǎo)因子1α上調(diào)，使細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)發(fā)生紊亂，最終導(dǎo)致惡性腫瘤。BTG1可參與表觀遺傳學(xué)調(diào)控作用，啟動(dòng)或維持基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化狀態(tài)，沉默相應(yīng)基因的表達(dá)，其能增強(qiáng)Cyclin E的表達(dá)，使細(xì)胞阻滯在S期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[19]。BTG1表達(dá)下降也可促進(jìn)癌基因的表達(dá)，如通過阻礙細(xì)胞色素C的釋放以抑制腫瘤細(xì)胞Caspase-3蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[20]。

NOD/SCID AML模型小鼠表現(xiàn)為全身性發(fā)病，血細(xì)胞呈典型“兩系增殖受抑、一系增殖過度”的表現(xiàn)，腹腔內(nèi)可出現(xiàn)明顯的瘤體，嚴(yán)重者甚至將器官粘連成實(shí)體瘤，導(dǎo)致疾病惡化[21-22]。本研究Pearson相關(guān)性分析顯示，AML模型小鼠BTG1、IKZF1蛋白相對表達(dá)水平與CD33陽性率、體重、紅細(xì)胞、血小板都存在相關(guān)性。從機(jī)制上分析，BTG1、IKZF1蛋白都可以誘導(dǎo)B、T淋巴細(xì)胞分化，調(diào)控細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期，并且可以通過調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)來調(diào)控Notch信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞分化抑制，加速白血病的發(fā)生與發(fā)展[23]。

綜上所述，BTG1、IKZF1蛋白在AML模型小鼠呈現(xiàn)高表達(dá)，其表達(dá)水平與小鼠體重、外周血及腫瘤浸潤程度存在相關(guān)性。但本研究也存在一定的不足，沒有進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析，也沒有進(jìn)行不同模型分析，因此將在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。