21基因檢測對早期Luminal A型乳腺癌治療指導作用研究

韓金怡，蘇志勇

(1.錦州醫科大學赤峰學院培養基地，內蒙古 赤峰 024000；2.赤峰學院附屬醫院乳腺外科，內蒙古 赤峰 024000；3.赤峰學院附屬醫院胸外科，內蒙古 赤峰 024000)

近年來臨床采用以手術為中心，以放化療、內分泌治療為輔助的綜合治療模式顯著降低了乳腺癌復發和病死率，但有一部分患者化療獲益甚少，在予以相同臨床干預情況下，后期疾病轉歸大不相同，醫生對化療獲益程度及復發風險等級的判斷缺乏客觀指標支持，因此乳腺癌尤其是早期乳腺癌患者術后管理及治療決策一直是臨床爭議的焦點，準確對其復發風險進行評估有重要意義[1-2]。基于此背景，乳腺癌21基因檢測應運而生。相關研究[3-4]發現，21個腫瘤相關基因的表達量和乳腺癌復發風險相關，該21個基因由6組基因組合而成。Luminal A型是乳腺癌患者常見的分子分型，研究[5]發現有脈管轉移、腫瘤直徑>2 cm、有淋巴結轉移是Luminal A型乳腺癌患者術后復發轉移的危險因素，但利用21基因檢測評估乳腺癌患者復發風險影響因素的研究甚少。本研究主要分析乳腺癌21基因檢測對早期Luminal A型乳腺癌治療的指導作用及其相關因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2019年12月內蒙古赤峰學院第一附屬醫院接受相關診治的雌激素受體(ER)和(或)孕激素受體(PR)陽性、人表皮生長因子受體-2(HER-2)陰性、經病理認定腋窩淋巴結轉移陰性的早期Luminal A型乳腺癌患者174例，均為女性，年齡18～70歲，平均(44.19±4.57)歲。病例納入標準：①術后經組織病理學確診為非特殊型浸潤性乳腺癌[6]；②ER/PR(+)，HER-2(-)或HER-2(+)或HER-2()，如果為HER-2()，則需經熒光原位雜交技術檢測且結果為陰性；③腋窩淋巴結轉移經病理檢測為陰性；④血常規、肝腎功能無明顯異常；⑤患者及家屬同意行21基因檢測并得出復發風險分數(RS)。排除標準：①全身檢查如磁共振、超聲、CT及PET/CT等發現有其他臟器轉移者；②對內分泌治療有禁忌證或在化療前經相關檢查有化療禁忌證者；③處于育齡期患者，經血清妊娠試驗結果為陽性，或正在哺乳期者；④有嚴重內臟器質性病變或體力狀況評分在1分以上、臨床資料不完整者。本研究經醫院相關倫理委員會書面同意，且患者或家屬均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組織化學染色：采用組織芯片制作機細針打孔方法從患者組織蠟塊(稱為供體蠟塊)中采集數十至上百圓柱形小組織(組織芯)，并將組織芯整齊排列到另一空白蠟塊(受體蠟塊)中，隨即制成組織芯片蠟塊。對組織芯片蠟塊進行切片后轉移到載玻片上制成組織芯片。將采集到的組織芯片制成4 μm連續切片，以二甲苯脫蠟和梯度酒精水化，切片后經檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)微波抗原修復，以3% H2O2及非免疫血清分別滅活內源性過氧化物酶活性與非特異性結合位點，再與一抗ER、PR、HER-2及Ki67于4 ℃條件下孵育過夜。第2天切片經PBS沖洗后滴加生物素標記的二抗，DAB顯色，蘇木素復染。PBS代替一抗做陰性對照，以排除二抗非特異性結合。

1.2.2 21基因檢測：采用羅氏Roche 480熒光定量PCR(RT-PCR)儀進行21基因檢測。由廣州閱微醫學檢驗所(以下簡稱檢驗所)與赤峰學院附屬醫院簽訂外送協議，檢驗所將21基因檢測結果與美國Oncotype Dx?試驗數據進行對比，結果應完全一致，以液相芯片技術替代傳統RT-PCR擴增技術檢測所有患者乳腺癌組織石蠟切片21基因在腫瘤組織中的表達情況。將檢測結果量化為RS。RS=20×(RSu-6.7)，其中Rsu為未校正的RS評分。RS范圍0～100分，數值越大，復發風險越高，越能從化療中獲益。RS<18分確定為低度復發風險，18分≤RS<31分確定為中度復發風險，RS≥31分確定為高度復發風險[7]。在本研究中，預先設定RS<18分為低風險組，RS≥18分為中高風險組。

1.2.3 治療方案選擇與評估：對患者進行術前病情評估，術后標本經組織芯片制備及免疫組織化學染色得出患者免疫組化結果及TNM分期，依據美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南[8]分為低復發風險組及高復發風險組，均由內蒙古赤峰學院第一附屬醫院乳腺外科科室根據指南討論后制定治療方案，對低復發風險組[進行單純內分泌治療(H方案)]和高復發風險組[進行化療序貫內分泌治療(CH方案)]。兩組患者均在其同意下進行21基因檢測并得出RS，再根據RS制定方案，當RS<18分時(低風險組)可單純進行H方案治療，當RS≥18分時(中/高風險組)可進行CH方案治療。利用傳統TNM分期結合NCCN指南制定兩組患者的不同治療方法，分別與21基因檢測所得出的RS及不同分組治療意見進行對比，總結兩組患者經不同檢測方法制定的治療方法間的差異，進而得出目前應用21基因檢測所帶來相應治療方案選擇上的精準度。

1.2.4 患者隨訪：對所有患者隨訪至2019年12月，中位隨訪時間36個月。隨訪方式為患者出院后定期復查結果、電話隨訪，21基因檢測前及檢測后所有患者均未出現局部或遠位臟器轉移情況。

1.2.5 資料收集：收集所有患者臨床資料，包括年齡、絕經狀態、腫瘤直徑、病理組織學分級、脈管癌栓、Ki67等，分析其與RS的相關性。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0統計學軟件處理數據，計數資料以[例(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗或配對卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 患者組織染色結果 見圖1。早期Luminal A型乳腺癌患者中ER、PR均為陽性表達。部分患者HER-2呈陽性表達或陰性表達，Ki67呈高表達或低表達。根據NCCN指南，只要ER、PR為陽性，即進行內分泌治療，且隨ER、PR陽性率增高，其內分泌治療效果越明顯。

A：ER(+)；B：ER(-)；C：PR(+)；D：PR(-)；E：HER-2()；F：HER-2(-)；G：Ki67高表達；H：Ki67低表達

2.2 21基因檢測及RS評估前后治療決策對比 見表1。21基因檢測及RS評估前，初步確定66例(37.9%)適用于H方案，均為低復發風險者；108例(62.1%)患者適用于CH方案，其中低風險者66例(37.9%)，中高風險者42例(24.2%)。經21基因檢測進行復發風險評估后決策發生變化，共132例(75.9%)建議進行H方案治療，其中66例(37.9%)從建議進行CH方案治療改為H方案治療，低風險者48例(27.6%)，中高風險者18例(10.3%)；建議進行CH方案者42例(24.2%)，其中低復發風險者6例(3.5%)，中高復發風險者36例(20.7%)，無增加輔助化療者。經統計學分析，21基因檢測及RS評估前后治療方案比較有統計學差異(P<0.01)。

表1 21基因檢測及RS評估前后治療決策對比[例(% )]

2.3 臨床特征與RS相關性分析 見表2。復發風險與年齡、絕經狀態、腫瘤直徑、病理組織學分級等無明顯相關性(均P>0.05)，而與Ki67表達及脈管癌栓相關(均P<0.01)。

表2 臨床特征與RS相關性分析[例(% )]

3 討 論

多數惡性腫瘤早期均無明顯癥狀、體征，乳腺癌患者在這方面尤其顯得突出。但隨著人們健康意識增強，很多乳腺癌患者通過體檢發現乳腺腫塊并通過其他手段得以確診，因此早期乳腺癌患者增加。隨著診療技術逐漸完善，早期乳腺癌患者經系統規范的綜合治療后，大多數取得較好預后[9]。乳腺癌為高度異質性疾病，其分子分型又稱為Luminal分型，是臨床上根據乳腺癌的免疫組化染色結果表現進行劃分的，至少分為十幾個亞型，因技術條件所限，臨床上無法精準分型，常分為Luminal A型、Luminal B型、HER-2陽性及三陰性乳腺癌[10-11]，其中Luminal A型為較常見分子亞型，復發率低，對內分泌治療敏感，對化療不敏感。乳腺癌21基因檢測的21個基因由6組基因組合而成，其中5組腫瘤相關基因包括增殖相關基因(Ki67、STK15、Survivin、Cyclin B1、Mybl2)、侵襲相關基因(Stromely sin3、Cathepsin L2)、HER-2相關基因(GRB7、HER-2)、激素相關基因(ER、PR、Bcl-2、Scube2)、其他基因(GSTM1、BAG1、CD68)以及內參基因(β-actin、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRC)[12-13]，然而目前關于21基因檢測在Luminal A型患者治療中的指導意義研究甚少。

楊玉慶等[14]發現，在乳腺癌患者中，與低危組比較，中高危組接受化療的患者更多；相較于21基因檢測之前，低危浸潤性癌有較明顯的治療決策改變。本研究中，21基因檢測及RS評估前初步確定66例適用于采用H方案，均為低復發風險者分別，占37.9%，而108例患者適用于CH方案，其中低風險、中高復發風險者分別占37.9%和24.2%；經21基因檢測進行復發風險評估后決策發生變化，共計132例建議進行H方案治療，其中66例(37.9%)從建議進行CH方案治療改為H方案治療，低風險者48例(27.6%)，中高風險者18例(10.3%)；建議進行CH方案治療者42例(24.2%)，其中低復發風險者6例，中高復發風險者36例，無增加輔助化療者。經統計學分析，21基因檢測及RS評估前后治療方法比較有統計學差異，表明21基因檢測對指導Luminal A型乳腺癌患者的治療有積極意義。

通過21基因檢測獲得的RS針對早期Luminal A型乳腺癌患者比傳統臨床病理指標更能準確預測臨床結果并用于臨床實踐。RS可作為預測早期Luminal A型乳腺癌患者遠期是否有復發風險的量化指標。高RS早期Luminal A型乳腺癌患者從CH方案治療中會有較大獲益；對于低RS早期Luminal A型乳腺癌患者來說，無需輔助化療，進行H方案治療即可；對中RS早期Luminal A型乳腺癌患者來說，CH方案治療能否降低疾病復發風險目前沒有明確結論，還需要后續進一步研究。本研究證明，使用21基因檢測及RS分級來判斷患者復發風險的高低對早期Luminal A型乳腺癌患者治療方案選擇具有重要臨床指導意義[15]。Wang等[16]也發現，在所有乳腺癌患者中，高RS被認為是推薦化療最重要的影響因素。對具有高RS的Luminal A樣亞型患者或具有低RS的Luminal B型患者，已證明21基因的RS為推薦化療最重要的獨立因素。因此，21基因RS是影響化學療法決策的重要因素，值得進一步臨床評估。

洪進等[17]發現，淋巴結轉移、年齡、月經狀態為影響Luminal A型早期乳腺癌化療決策的重要因素，70歲以上患者或淋巴結陰性的絕經后患者傾向于不接受化療。Wu等[18]認為，組織分級、PR狀態、Ki67均為RS的獨立影響因素。瞿飛麟等[19]發現，在激素受體陽性早期乳腺癌患者中，孕激素受體(PGR)、Ki67及組織學分級為影響RS的獨立影響因素。由于缺乏統一的標本制作程序以及Ki67表達陽性率檢測方法及其臨床界值界定，目前區分Ki67高低表達的臨界值從3.5%～34%均有報道。本研究考慮到不同實驗室Ki67表達陽性率檢測方法不同可能造成結果很大程度上的差異，及對化療可能受益的Luminal A型乳腺癌治療不足的可能，因此選擇較低界值(14%)進行界定，發現其對21基因RS有一定影響。本研究也發現21基因檢測及復發風險分組與早期Luminal A型乳腺癌患者年齡、組織病理學分級(1～2級)、女性月經狀態、腫瘤直徑等無相關性，而與Ki67及有無脈管癌栓呈正相關。對于早期Luminal A型乳腺癌患者來說，這些既往被歸為增加復發危險分級的因素可通過21基因檢測給予RS所替代，RS分析的作用顯著優于年齡和腫瘤大小作為獨立預后因素的作用[20-21]。

綜上所述，21基因檢測對早期Luminal A型乳腺癌患者的治療決策具有一定指導意義，RS僅與Ki67表達、脈管癌栓有相關性，因此可通過21基因檢測給予RS替代年齡、腫瘤直徑等作為獨立預后因素。但本研究也有一定不足之處：對于早期Luminal A型乳腺癌患者無病生存和總生存數據仍在進一步收集中，目前還無法得出結論；此外，由于研究周期及經濟成本等原因，本研究患者入組例數較少，暫無法從經濟學角度對21基因檢測進行成本效益分析。上述不足將在后續工作中加以完善，以提高21基因檢測及RS在早期Luminal A型乳腺癌患者臨床實踐中的地位。