2G型肢帶肌營養不良癥斑馬魚疾病模型的構建

李麗萍 鐘靜 牛玉娟 孫源超 吳傳鴻 李美航 周建峰 丁永和

(青島大學，山東 青島 266071 1 基礎醫學院生物化學與分子生物學系； 2 生物醫學研究院)

2型肢帶肌營養不良癥(LGMD2)是一類具有肢帶肌無力、肌肉萎縮臨床表現的常染色體隱性遺傳的家族性疾病[1]，根據致病基因的不同可分為不同的亞型，其中LGMD2G是LGMD2的亞型之一，是由定位于17q12區域的編碼Telethonin蛋白的TCAP基因突變導致的[2]，在中國、印度和歐洲等國家人群中均有發現[2,3-7]。LGMD2G的主要臨床特征是遠端肢體肌無力，患者在20歲左右開始出現下肢無力癥狀，約40%的患者在40歲左右失去了獨立行走的能力[8]，生活質量受到嚴重影響。鑒于LGMD2G發病機制尚不明確，目前臨床上尚沒有針對LGMD2G的有效治療手段。

由于人類遺傳學研究的限制，LGMD2G疾病相關分子機制的研究主要依賴于動物模型。斑馬魚用于科學研究已有80多年的歷史[9]，因具有體積小、繁殖能力強、易于基因改造的優點，目前廣泛應用于藥物的篩選[10]，在動物疾病模型的構建中也顯示出了其特有的優勢，然而目前LGMD2G斑馬魚疾病模型的構建及致病機制的研究還處于初步探索階段。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術致斑馬魚tcap基因突變來構建LGMD2G的活體動物模型，并進一步利用該模型初步探討tcap基因在LGMD2G中的功能以及潛在作用機制，旨在為進一步研究LGMD2G的致病機制以及進行治療藥物的篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物和材料

Tübingen 品系斑馬魚由中國海洋大學分子醫學生物學實驗室提供，人工養殖于自動水循環系統中。T7核酸內切酶、胚胎牛血清(FBS)、T7體外轉錄試劑盒、DNase Ⅰ(美國Thermo 公司)，異丙醇、20×SSC 緩沖液、氯仿-異戊醇等(上海生工生物工程股份有限公司)，KOD(plus)和KOD F(x)DNA聚合酶(日本TOYOBO 公司)，反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(加拿大ABMgood公司)，酚紅、多聚甲醛(美國Sigma 公司),蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，地高辛(DIG) 抗體、DIG 標記的 NTP(瑞士Roche 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1小向導RNA(sgRNA)合成和顯微注射 依據從美國國家生物技術信息中心(NCBI)網站下載的斑馬魚tcap基因序列設計CRISPR/Cas9靶點，靶點的序列為5′-ATTGATGCTGCGCCAGTCAG-

3′。根據靶點序列設計sgRNA合成所需引物，以pT7-gRNA質粒為模板進行PCR擴增，用酚-氯仿抽提法抽提PCR產物，利用T7體外轉錄試劑盒合成sgRNA，用體積分數為0.01的瓊脂糖膠進行核酸電泳，檢測sgRNA是否制備成功。sgRNA制備成功后用酚紅將sgRNA稀釋為400 mg/L，將Cas9蛋白與400 mg/L的sgRNA各取1 μL混勻，將sgRNA稀釋為終濃度200 mg/L，將1 nL上述稀釋液于顯微鏡下注射至野生型(WT)斑馬魚胚胎卵黃(發育時期為1細胞期)中，然后胚胎置于培養液中于28.5 ℃恒溫培養箱中培養。

1.2.2tcap基因純合突變斑馬魚篩選 將于顯微鏡下注射后的斑馬魚胚胎培養2～3 d，然后進行基因組提取。通過Prime 5.0軟件設計篩選tcap基因突變斑馬魚的引物序列如下：F-5′-GTTTGGATA-TGTGGGTG-3′，R-5′-AAATGTAGCCTACTGG-TG-3′；PCR擴增以后進行T7核酸內切酶酶切，選擇能切開的PCR產物進行DNA測序，篩選獲得F0代tcap基因突變斑馬魚。成年后將其與WT斑馬魚交配獲得F1代tcap基因突變斑馬魚。對成年后的F1代tcap基因突變斑馬魚進行篩選并確定突變類型，將相同突變類型的F1代tcap基因突變雌雄斑馬魚交配后，再次篩選獲得F2代tcap基因突變斑馬魚，即為tcap基因純合突變斑馬魚。然后通過GENEDOC軟件分析tcap基因純合突變斑馬魚的tcap基因所編碼的telethonin蛋白氨基酸序列的變化情況。

1.2.3斑馬魚骨骼肌組織石蠟切片以及HE染色成年WT和tcap基因純合突變斑馬魚安樂死后切取骨骼肌組織，置于體積分數為0.04的多聚甲醛溶液中固定，經水洗、梯度脫水、透明、透蠟后進行石蠟包埋和切片；將切片后的組織進行脫蠟和梯度復水，以蒸餾水沖洗組織切片5 min后用蘇木精染料染色3 min；然后經含體積分數0.01的鹽酸乙醇溶液沖洗后再以蒸餾水沖洗12 min，伊紅染料染色30 s；經乙醇和二甲苯處理后封片，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4斑馬魚最大游泳速度檢測 選取體長(BL)和體質量相近的成年WT斑馬魚(A組)和tcap基因純合突變斑馬魚(B組)，每組10條，禁食24 h，后使用新一代斑馬魚專用游泳速度測試系統(Loligo系統，丹麥)，參照相關文獻[11]，測量A組和B組斑馬魚的最大游泳速度，為了減少斑馬魚不同個體間BL差異所產生的誤差，將最大游泳速度單位換算為BL/s。

1.2.5斑馬魚胚胎的分組及其處理 依據文獻[12]對受精后24 h(24hpf)的原基-5期和受精后72 h(72hpf)的突口期斑馬魚胚胎進行區分，同時依據處理方式不同，將WT斑馬魚胚胎分為空白對照組(C組)、漂白劑處理組(D組)、剪切損傷處理組(E組)和加蘭他敏處理組(F組)。再將WT斑馬魚胚胎和M1型tcap基因純合突變斑馬魚胚胎分為WT斑馬魚胚胎空白對照組(G組)、WT斑馬魚胚胎加蘭他敏處理組(H組)、M1型tcap基因純合突變斑馬魚胚胎空白對照組(I組)和M1型tcap基因純合突變斑馬魚胚胎加蘭他敏處理組(J組)，每組30枚胚胎。C、G和I組對72hpf的WT斑馬魚胚胎或者tcap基因純合突變斑馬魚胚胎進行正常培養，沒有進行任何處理；D組用含體積分數0.022 5的漂白劑溶液處理24hpf的WT斑馬魚胚胎2 min，正常培養至72hpf收集胚胎；E組用刀片在顯微鏡下損傷72hpf的WT斑馬魚胚胎尾部骨骼肌組織，3 h后收集胚胎；F組、H組和J組用濃度為0.5 mmol/L的加蘭他敏溶液處理24hpf的WT斑馬魚胚胎或者tcap基因純合突變斑馬魚胚胎48 h后，收集胚胎。

1.2.6斑馬魚整胚原位雜交及RT-qPCR實驗 參照RONG等[13]報道的方法進行原位雜交，檢測C～F組WT斑馬魚胚胎中tcapmRNA顯色情況；對于C～J組斑馬魚胚胎進行RT-qPCR檢測：將斑馬魚胚胎于200 μL Trizol試劑中碾碎，然后依次加入Trizol試劑、氯仿、異丙醇、體積分數0.75乙醇溶液，分離并提取總的RNA；采用5×All-In-One-RT-MasterMix反轉錄試劑盒進行反轉錄獲得cDNA，以此cDNA為模板采用SYBR Green Master Mix試劑盒進行RT-qPCR反應，以β-actin作為內參照，檢測斑馬魚胚胎中tcap、p53和p21 mRNA的表達水平。RT-qPCR引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物名稱及其序列

1.3 統計學處理

使用GraphPad Prism 8.0軟件進行數據統計分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 tcap基因純合突變斑馬魚篩選結果

對設計合成的sgRNA進行核酸電泳，顯示為一條長約100 bp的單一核酸條帶，表明成功合成了斑馬魚tcap基因編輯所需的sgRNA；于顯微鏡下注射sgRNA與Cas9蛋白復合物對WT斑馬魚胚胎tcap基因進行編輯，并最終篩選獲得了兩種基因型不同的tcap基因純合突變斑馬魚，分別為缺失堿基GCGCCAGTC和增加堿基TCTATCTATCT的M1型以及缺失堿基CTGCGCCAGT的M2型(圖1)；通過GENEDOC軟件分析發現，這兩種tcap基因純合突變斑馬魚都會產生telethonin截短蛋白，從而導致tcap基因功能喪失。由于M1型tcap基因純合突變斑馬魚所編碼的telethonin截短蛋白氨基酸個數最少，因此后續均使用M1型tcap基因純合突變斑馬魚進行實驗。

2.2 WT與M1型tcap基因純合突變斑馬魚骨骼肌組織HE染色結果

HE染色實驗結果顯示，成年WT斑馬魚的骨骼肌肌原纖維排列規則(圖2A)，而成年M1型tcap基因純合突變斑馬魚的骨骼肌肌原纖維排列明顯紊亂(圖2B)。

紅色線條標記突變區

A:WT斑馬魚，B:M1型tcap基因純合突變斑馬魚，箭頭指向紊亂的肌原纖維，HE染色，400倍

2.3 WT與M1型tcap基因純合突變斑馬魚最大游泳速度檢測結果

檢測結果顯示，A組和B組斑馬魚的最大游泳速度分別為(22.78±2.25)、(18.67±2.95)BL/s，兩組比較差異具有顯著性(t=3.32，P<0.05)。

2.4 不同處理方式下WT斑馬魚胚胎中tcap mRNA表達情況

原位雜交實驗結果顯示，與C組比較，D～F組WT斑馬魚胚胎中tcapmRNA的紫色顯色區域明顯增加(圖3)。RT-qPCR實驗結果顯示，C～F組WT斑馬魚胚胎中tcapmRNA的相對表達量分別為1.00±0.00、9.64±0.42、8.20±2.52、9.88±1.78，組間比較差異具有顯著性(F=21.70，P<0.05)，其中與C組相比，D～F組tcapmRNA相對表達量明顯升高(t=4.95～35.44，P<0.05)。

2.5 各組斑馬魚胚胎中p53、p21 mRNA相對表達量比較結果

RT-qPCR實驗結果顯示，G～J組斑馬魚胚胎中p53 mRNA的相對表達量分別為1.00±0.00、1.03±0.27、0.75±0.11、0.46±0.11，p21 mRNA相對表達量分別為1.00±0.01、0.82±0.15、0.73±0.04、0.36±0.06，組間比較差異均具有顯著性(F=8.45、33.04，P<0.05)；H組與G組比較，斑馬魚胚胎中p53和p21 mRNA相對表達量均無顯著差異(P>0.05)；J組與H、I組比較，斑馬魚胚胎中p53、p21 mRNA相對表達量明顯下降(t=3.24～8.94，P<0.05)。

A、B、C、D分別對應C、D、E、F組，箭頭指示剪切位點，原位雜交，40倍

3 討 論

在基因編輯過程中，一般先通過基因編輯工具誘導染色體DNA形成一個斷裂缺口，然后細胞啟動DNA修復；此時DNA斷裂的地方會在修復過程中插入或者刪去堿基，進而導致靶基因產生移碼或缺失突變[14]。CRISPR系統最早在大腸桿菌中被發現[15]。經CRISPR系統改造而來的CRISPR/Cas9基因編輯技術，具有效率高、能對基因組進行精確編輯等優勢，從而廣泛應用于動物模型的構建[14]。本研究將CRISPR/Cas9基因編輯技術應用于斑馬魚活體動物模型，成功獲得了tcap基因功能缺失的純合突變斑馬魚。

人類的TCAP基因定位于17號常染色體，其編碼的Telthonin蛋白共由167個氨基酸組成，相對分子質量為19 000。該蛋白具有獨特的β-折疊結構，存在于肌節Z盤[16-17]。Telethonin蛋白存在于骨骼肌、心肌和腸胃道平滑肌中，其主要功能是維持肌組織的結構穩定性。TCAP的隱性無義或缺失突變會導致LGMD2G。LGMD2G患者會出現遠端肢體肌肉力量逐漸減弱的情況，最終失去行動能力[2,8]。本研究HE染色實驗結果顯示，在tcap基因純合突變斑馬魚中能檢測到明顯的骨骼肌肌原纖維紊亂表型，提示tcap基因的功能喪失直接影響了斑馬魚骨骼肌功能，從而支持tcap維持骨骼肌肌肉結構穩定性的理論。本研究中斑馬魚最大游泳速度測試結果顯示，tcap基因功能缺失純合突變斑馬魚的運動能力顯著降低。這些表型與在LGMD2G患者中出現的肌肉萎縮和肌肉力量減弱或缺失的癥狀是基本一致的[6]，提示本研究成功構建了斑馬魚LGMD2G模型。

根據文獻報道，漂白劑處理導致的機械刺激會使斑馬魚胚胎骨骼肌組織機械壓力過載，從而導致tcap基因相對表達量增加[18]。加蘭他敏是一種乙酰膽堿酯酶抑制劑，能夠使肌肉組織受到生物刺激；剪切損傷處理會使斑馬魚胚胎骨骼肌組織產生損傷應激反應。為了進一步探討tcap基因突變導致斑馬魚LGMD2G的致病機制，本研究檢測了WT斑馬魚的tcap基因在以上處理方式下的表達情況，原位雜交和RT-qPCR實驗結果顯示，除漂白劑處理外，加蘭他敏處理和剪切損傷處理也會誘導WT斑馬魚胚胎tcapmRNA相對表達量增加。MDM2蛋白既能降解P53蛋白又能降解Telethonin蛋白[19-20]，提示Telethonin蛋白可能參與了P53信號通路的調控。本研究的RT-qPCR實驗結果顯示，tcap基因純合突變斑馬魚胚胎經加蘭他敏處理后，其骨骼肌中p53以及p21 mRNA相對表達量明顯降低，提示斑馬魚LGMD2G的發病機制很可能與tcap基因缺失后肌組織營養不良導致p53信號通路異常有關。

研究發現，Telethonin能與肌LIM蛋白(MLP)進行相互作用，而小鼠MLP蛋白表達降低會誘發肥厚型心肌病和心力衰竭[21]。TCAP基因缺失是否會影響MLP蛋白功能導致骨骼肌功能異常，從而誘發LGMD2G還有待進一步研究。除此之外，多種信號通路相關蛋白如肌聯蛋白、骨形態發生蛋白10和離子通道蛋白Nav1.5等都能與Telethonin蛋白等進行相互作用[22-25]，這些蛋白是否也參與了LGDM2G的發生發展目前尚無研究報道，表明LGMD2G的致病機制研究還處于初步探索階段。

總之，本研究首次成功構建了LGMD2G的斑馬魚疾病模型，并初步發現tcap基因功能缺失導致p53基因下調可能是斑馬魚LGMD2G的致病機制之一。但是關于斑馬魚tcap基因通過p53基因如何調控下游相關信號通路進而導致LGMD2G還有待進一步研究。本研究為LGMD2G治療藥物的篩選提供了一定的理論基礎。