miR-496通過SFMBT1抑制子宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的相關研究

方艷惠，馬彩娟，張純麗，翟嘉威，朱巧英，劉 茵，趙喜娃

1.河北醫科大學第四醫院東院區婦科，河北 石家莊 050011；2.晉州同濟醫院婦產科，河北 石家莊 052260

子宮頸癌［1-2］是女性常見的腫瘤之一，高危型人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是其主要致病因素［3］，盡管有強大的致癌潛力，但研究發現HPV感染本身并不足以引起腫瘤惡性變化［4］。隨著研究的深入，已證實包括miRNA在內的其他因子也與子宮頸癌發生、發展密切相關［5］，因此探究子宮頸癌的具體分子機制至關重要。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內源的非編碼RNA。miRNA的失調與多種人類癌癥有關，在子宮頸癌中，多種miRNA處于失調狀態，并參與調控子宮頸癌發病機制。Wang等［6］研究發現，miR-449a在子宮頸癌組織和細胞中表達降低并與淋巴結轉移、分化、預后不良密切相關。一項研究［7］發現，miR-10b在子宮頸癌組織中表達降低，進一步研究發現，隨著子宮頸癌進展其表達下降明顯，同時miR-10b低水平與具有侵襲性的腫瘤表型顯著相關。目前，越來越多的證據表明miRNAs表達異常與子宮頸癌病理進程相關。MiR-496已被發現在諸多人類癌癥中起促/抑癌基因的作用，進而參與癌癥發展過程［8-9］，但在子宮頸癌中的作用機制鮮見報道。本研究旨在觀察體外轉染miR-496對子宮頸癌細胞的影響，并通過分析其與SFMBT1的（通過TargetScan預測為miR-496潛在靶基因）相互關系，揭示miR-496在子宮頸癌中的作用及其機制。

1 資料和方法

1.1 研究樣本采集

子宮頸癌的癌組織標本和癌旁組織標本來自河北醫科大學第四醫院接受手術的81例子宮頸癌患者。本研究所涉及標本患者均簽署知情同意書，并獲得本院倫理委員會批準。

1.2 細胞培養和轉染

HeLa細胞使用含10%胎牛血清，l00 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基，培養箱中CO2體積分數為5%，溫度為37 ℃。轉染前24 h將細胞接種于6孔板，將子宮頸癌細胞系分為對照組、SFMBT1處理組、miR-496 mimics處理組和miR-496+SFMBT1處理組，隨后按照轉染試劑說明書對細胞進行轉染。

1.3 雙熒光素酶報告基因實驗

通過miRNA數據庫發現miR-496在SFMBT1的3’-UTR上的潛在結合位點，構建了野生型SFMBT13’-UTR（SFMBT1-wt）質粒和突變型SFMBT13’-UTR（SFMBT1-mut）質粒，隨后，將SFMBT1-wt或者SFMBT1-mut和miR-496 mimic或NC模擬物共轉染HeLa細胞48 h，隨后測量細胞中的熒光素酶活性。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

使用TRIzol從細胞系或組織中提取總RNA，miR-496的表達水平以U6為內參，GAPDH為SFMBT1表達內參，按照RTFQ-PCR試劑盒說明書進行PCR，每個樣本重復3次。

1.5 蛋白質印跡法（Western blot）檢測

提取子宮頸癌或癌旁組織、細胞蛋白，測定蛋白濃度，與12%SDS-PAGE分離蛋白后進行轉膜，用5%脫脂奶粉37 ℃封閉。加入SFMBT1一抗，溫育。洗膜后加入二抗。ECL液暗室發光顯影，定影。

1.6 H-E染色

將石蠟切片放入染缸內，進行脫蠟。先用蘇木精染液浸泡10 min，洗去浮色；用伊紅染液浸泡2 min，然后用蒸餾水速洗30 s。用70%的乙醇浸泡30 s；然后再用80%乙醇、95%乙醇（Ⅰ）及 95%乙醇（Ⅱ）各浸泡1 min；最后用無水乙醇（Ⅰ）和無水乙醇（Ⅱ）各浸泡2 min。切片放入二甲苯（Ⅰ）與二甲苯（Ⅱ）中各浸泡3 min。將透明后的切片從染色缸中取出，切片一面朝上，平放在鋪有吸水紙的桌面上，用吸水紙吸盡切片周圍的透明液，然后用小玻璃棒蘸取一滴中性快干膠滴于材料上，用鑷子取一片蓋玻片，讓蓋玻片一側接觸快干膠后再慢慢平放在快干膠上，完成封固。將封好的切片平放于溫箱中，待干燥后，即可在顯微鏡下觀察。

1.7 免疫熒光實驗

將組織切片脫蠟入水，微波加熱法修復抗原，溫度94 ℃左右，10～15 min，自然冷卻至室溫。加入5%的正常羊血清封閉，37 ℃溫育60 min。棄去血清，滴加1∶500比例稀釋的SFMBT1抗體，4 ℃過夜。棄一抗，PBS沖洗 3次，滴加熒光素標記的二抗，37 ℃避光溫育 60 min。棄二抗，PBS沖洗3次，防淬滅封片劑封片，4 ℃避光保存。熒光顯微鏡觀察拍照。

1.8 細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）實驗

96孔板每孔鋪HeLa細胞，每孔200 μL細胞懸液。細胞在轉染72 h后，按照CCK-8試劑盒操作說明書于每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃培養箱中溫育1 h，450 nm波長下進行吸光度（D）檢測。

1.9 Transwell實驗

轉染后，收集每組細胞，Matrigel基質膠于 4 ℃條件下過夜，次日Matrigel基質膠對transwell 小室進行預包被，將細胞密度調為1×106個/mL，然后將200 μL細胞懸液接種于上室，在下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養基，隨后恒溫培養箱培養24 h。取出小室后，將小室置于95%乙醇中固定5 min；在0.5%結晶紫染色液中染色10 min后，用PBS漂洗去除未結合細胞的染色液。用棉簽輕拭去小室濾膜上層的細胞，在顯微鏡下觀察濾膜下層細胞。

1.10 構建子宮頸癌裸小鼠移植瘤模型

本研究中動物實驗經河北醫科大學第四醫院動物實驗委員會批準，選取BALB/c裸小鼠12只，6～8周，體重19～23 g。取對數生長期細胞消化后，1 200 r/min離心3 min，定量的PBS緩沖液及培養基將細胞吹打濃度至5×106個/mL，接種前，細胞置于冰上保存。所有裸小鼠隨機分為對照組（6只）和miR-496組（6只）。將以PBS緩沖液混懸的細胞和以完全培養基混懸的細胞分別接種在裸小鼠的左后肢腋下及右后肢腋下，以每個接種部位0.2 mL皮下注射。每3 d用游標卡尺測量腫瘤的長徑（b）、短徑（a），計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，腫瘤體積計算公式：V=a2×b×0.5。21 d后，頸椎脫臼處死小鼠，剪開腫瘤生長處的皮膚，取出腫瘤并稱重。

1.11 統計學處理

采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析，數據以表示，兩組數據間的比較采用t檢驗，3組及以上的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮頸癌組織中SFMBT1的表達

免疫熒光結果顯示SFMBT1蛋白在子宮頸癌組織中的表達明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01，圖1A）。采用RTFQ-PCR、Western blot檢測SFMBT1在子宮頸癌組織和癌旁組織中的表達水平，結果顯示，相比癌旁組織，子宮頸癌組織中SFMBT1的mRNA表達水平（1.69±0.23vs1.00±0.12）以及蛋白水平（1.73±0.28vs1.00±0.15）均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.001，圖1）。

圖1 子宮頸癌組織中SFMBT1的表達變化Fig.1 The expression of SFMBT1 in cervical cancer tissues

2.2 TargetScan篩選miR-496的靶基因及調控

采用TargetScan篩選miR-496的潛在靶基因，結果顯示，SFMBT1的3’-UTR上具有潛在的結合位點與miR-496形成互補結合（圖2A）。通過雙熒光素酶報告基因實驗發現，pMIR-SFMBT1-wt+miR-NC組、pMIR-SFMBT1-wt+miR-496組HeLa細胞熒光素酶活性分別為17.68±1.81、13.34±1.51，P<0.01）；pMIR-SFMBT1-mut+miR-NC組、pMIR-SFMBT1-mut+miR-496組HeLa細胞熒光素酶活性分別為19.16±2.04、17.78±1.84，差異無統計學意義（P=0.43，圖2B）；提示miR-496 mimics可抑制pMIRSFMBT1-wt熒光素酶活性，而對pMIR-SFMBT1-mut熒光素酶活性無影響。

圖2 SFMBT1是miR-496潛在靶基因Fig.2 SFMBT1 is a potential target gene of miR-496

將miR-496 mimics轉染進HeLa細胞后，RTFQPCR結果顯示HeLa細胞中miR-496的表達水平較對照組明顯升高（7.15±0.78vs1.00±0.14，P＜0.01，圖3A），提示 miR-496 mimics轉染成功，然后采用RTFQ-PCR和Western blot檢測轉染成功后SFMBT1表達的變化，結果顯示，相比對照組，miR-496過表達的細胞中SFMBT1的mRNA表達和蛋白水平均明顯降低，差異均有統計學意義（0.81±0.07vs1.00±0.15，0.26±0.02vs1.00±0.14，P＜0.01，圖3B、C）。

圖3 miR-496負調控SFMBT1表達Fig.3 miR-496 negatively regulated the expression of SFMBT1

2.3 miR-496和SFMBT1對HeLa細胞生物行為的調控

用CCK-8增殖實驗檢測各組細胞的增殖能力。結果顯示，相比對照組，SFMBT1處理組增殖能力提高（2.78±0.13vs2.01±0.09）而miR-496處理組中D值明顯降低（1.39±0.10vs2.01±0.09），進一步發現miR-496+SFMBT1處理組的D值明顯高于miR-496 mimics處理組（2.35±0.19vs1.39±0.10）。采用transwell實驗檢測各組細胞的遷移和侵襲能力，結果顯示，相比對照組，miR-496 mimics處理組中遷移（40.50±3.17vs28.42±1.21）和侵襲（15.03±1.67vs25.71±2.56）細胞計數均明顯降低，而SFMBT1處理組相對升高（39.64±1.78vs28.42±1.21和37.45±2.89vs25.71±2.56），進一步發現miR-496+SFMBT1處理組遷移（33.21±2.66vs19.28±1.50）和侵襲（30.11±2.73vs15.03±1.67）細胞計數較miR-496處理組明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.01，圖4）。

圖4 miR-496和SFMBT1對HeLa細胞生物學行為的調控Fig.4 Regulation of biological behavior of HeLa cells by miR-496 and SFMBT1

2.4 miR-496在子宮頸癌裸小鼠移植瘤模型中的作用

選取BALB/c裸小鼠12只，隨機分為對照組（6只）和miR-496組（6只），HeLa細胞分別轉染miR-NC或miR-496 mimics并皮下注射到裸小鼠的右后肢腋部，每只裸小鼠接種細胞數為2×106個，構建子宮頸癌裸小鼠移植瘤模型。21 d后顯示，miR-496組裸小鼠中不同時間點的移植瘤體積明顯低于對照組（圖5A），同時miR-496組腫瘤重量明顯降低（0.44±0.08vs0.25±0.04，P<0.01，圖5B）。采用H-E染色和免疫熒光檢測各組裸小鼠腫瘤組織中病變程度、SFMBT1表達和Ki-67增殖指數，結果顯示，miR-496組裸小鼠中病變程度、SFMBT1表達和Ki-67增殖指數均明顯低于對照組（圖5C），差異均有統計學意義（P<0.01）。表明miR-496在子宮頸癌裸小鼠移植瘤模型中能抑制子宮頸癌病變及細胞增殖。

圖5 miR-496在子宮頸癌裸小鼠移植瘤模型中的作用Fig.5 The role of miR-496 in cervical cancer xenograft model of nude mice

3 討 論

SFMBT1是一種轉錄抑制因子，研究［10-11］發現，其與癌細胞上皮-間質轉化及細胞增殖侵襲等相關。Liu等［12］的研究團隊發現，SFMBT1敲除可抑制透明細胞性腎細胞癌的增殖，抑制原位腫瘤的生長；在子宮頸癌中，SFMBT1的過表達誘導子宮頸癌細胞上皮-間質轉化，增強子宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力［13］；與以往研究結果類似，本研究通過免疫熒光等實驗發現SFMBT1在子宮頸癌組織中的表達相比對照組明顯升高，SFMBT1可能作為癌基因參與子宮頸癌的發生、發展。本研究通過生信分析，證實SFMBT1可能是miR-496潛在靶基因，并驗證了這一結論，發現SFMBT1可能受miR-496調控影響。為了進一步驗證兩者對子宮頸癌發生、發展的影響，本研究從細胞和動物水平觀察了miR-496及其靶基因SFMBT1對子宮頸癌細胞和體內腫瘤生長的影響。

miR-496已被證實與多種癌癥發病機制相關。在非小細胞肺癌中，miR-496通過靶向腦源性神經營養因子介導的PI3K/Akt信號通路抑制腫瘤發生［14］；在結腸癌中，miR-496/RASSF軸參與Wnt通路介導的腫瘤轉移［9］，但miR-496在子宮頸癌中的作用尚不清楚。本研究發現，miR-496過表達的裸小鼠中移植瘤體積和重量明顯低于對照組，表明miR-496可抑制裸小鼠瘤體的生長，提示miR-496可能具有抑制子宮頸癌的功能。

miRNA主要通過調控靶基因進而發揮生物學功能［15］，因此，探究miRNA功能的關鍵環節是確定其靶基因。在本研究中利用TargetScan發現miR-496在SFMBT1的3’-UTR上具有潛在的結合位點，表明SFMBT1是其潛在靶基因。為了進一步驗證這一預測，雙熒光素酶報告基因實驗的結果證實miR-496 mimics能抑制SFMBT1野生型3’-UTR報告基因質粒的熒光素酶活性，但對其突變型報告基因質粒的熒光素酶活性無明顯影響。同時，在HeLa細胞中過表達miR-496能下調SFMBT1的mRNA和蛋白的表達，表明miR-496的確能與SFMBT1的3’-UTR特異性結合并抑制其 表達。

我們進一步通過體外實驗分析miR-496與SFMBT1對子宮頸癌細胞生物學行為的影響。實驗結果顯示，轉染miR-496 mimics能抑制HeLa細胞增殖、遷移和侵襲能力，但在細胞中同時高表達SFMBT1則能逆轉miR-496的這種抑制效果。表明miR-496是通過靶向調控SFMBT1從而抑制子宮頸癌細胞的生物學行為。在子宮頸癌裸小鼠移植瘤模型中，miR-496過表達也能下調SFMBT1的表達水平，并抑制細胞的增殖及腫瘤生長，進一步驗證了miR-496在子宮頸癌中的抗腫瘤功能。

綜上所述，本研究實驗結果表明miR-496的低表達與子宮頸癌密切相關，miR-496可抑制子宮頸癌HeLa細胞的惡性生物學行為，并且能通過靶向SFMBT1抑制子宮頸癌發生、發展，抑制子宮頸癌裸小鼠移植瘤的生長。