PKLR在胰腺癌中的表達(dá)水平及臨床病理學(xué)意義

楊士鵬，劉 穎，王馨悅，楊 洋，全吉淑，林貞花

1.延邊大學(xué)腫瘤研究中心，吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院外科，吉林 延吉 133002；3.民族地區(qū)高發(fā)腫瘤病理生物學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（延邊大學(xué)），吉林 延吉133002 4.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，吉林 延吉133002

胰腺癌惡性程度高，其發(fā)病率呈逐年上升及年輕化趨勢，病死率在惡性腫瘤中位居第4［1］。由于胰腺癌早期診斷困難，侵襲性強(qiáng)，惡性程度高［2-3］，患者的5年生存率<1%［4］。隨著基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的快速發(fā)展，涌現(xiàn)出大量生物學(xué)分子標(biāo)志物如CA19-9、CEA、CA242、OPN等，但特異性和敏感性等仍顯不足［5］。因此，闡明胰腺癌的潛在分子機(jī)制并尋找更有效的腫瘤分子標(biāo)志物對于胰腺癌早期診斷及分子靶向治療至關(guān)重要。

丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶，可催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，同時使ADP轉(zhuǎn)化為ATP以供給細(xì)胞能量［6］。PK家族主要包括4種同工酶，分別是PKLR基因編碼的PK-L、PK-R以及PKM2基因編碼的M1和M2［7］。其中，PKLR基因位于染色體1q21，共包含12個外顯子，主要表達(dá)于肝臟、紅細(xì)胞中［8］。有報道稱，PKLR基因缺陷是紅細(xì)胞丙酮酸激酶缺乏的主要原因，也是遺傳性非球形細(xì)胞溶血性貧血的常見原因［9-10］。近年的研究［11-12］顯示，PKLR在腫瘤的惡性演進(jìn)中扮演著重要的促進(jìn)作用。Nguyen等［11］報道，PKLR蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的臨床分期和分化程度密切相關(guān)，其高表達(dá)提示患者的不良預(yù)后。Niinivirta等［12］亦證實(shí)，PKLR與腎細(xì)胞癌的惡性演進(jìn)密切相關(guān)。本文旨在探究PKLR蛋白對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為胰腺癌早期診斷及靶向治療提供可能的分子標(biāo)志物。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系

人胰腺癌BxPC-3和MIA PaCa-2細(xì)胞，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 材料

組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司，包括109例胰腺癌組織和28例癌旁胰腺組織標(biāo)本。統(tǒng)計109例胰腺癌標(biāo)本的臨床病理學(xué)資料（部分臨床數(shù)據(jù)缺失）：男性59例，女性50例；年齡＜60歲的患者數(shù)為41例，≥60的患者數(shù)為68例；腫瘤直徑＜3.0 cm的患者數(shù)為15例，≥3.0 cm的患者數(shù)為37例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者數(shù)為60例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者數(shù)為46例；胰腺癌組織分化程度：高分化者7例，中分化者41例，低分化者14例；胰腺癌組織分期分析：Ⅰ+Ⅱ期87例，Ⅲ+Ⅳ期22例。

1.3 試劑

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶等試劑購自美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffered saline，PBS）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、Hoechst33342熒光染料、MTT［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide］購自北京索萊寶生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；熒光二抗Alexa Fluor468購自美國Invitrogen公司，分裝保存于-20 ℃冰箱。

1.4 儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱，全波長多功能酶標(biāo)儀。光學(xué)倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，臺式高速離心機(jī)購自美國Thermo公司。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

將BxPC-3和MIA PaCa-2細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)

將BxPC-3和MIA PaCa-2細(xì)胞以每孔100 μL（1×103個細(xì)胞）接種于96孔板，每個濃度設(shè)5個平行復(fù)孔。次日，每孔加入5 mL/mg的MTT溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清液，加入DMSO，振蕩，用全波長酶標(biāo)儀于490 nm和570 nm波長測定吸光度（D）值。根據(jù)公式計算：細(xì)胞生存率=D處理組/D對照組×100%。

1.7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的BxPC-3和MIA PaCa-2細(xì)胞，以每孔2 000個的細(xì)胞密度接種于6孔板中，次日更換為完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，肉眼可見含有60個以上的細(xì)胞集落時，用預(yù)冷PBS清洗2次，室溫下4%多聚甲醛固定15 min，蘇木精染液染色，自然干燥后拍照。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞等量接種于6孔板中，待細(xì)胞的融合度達(dá)到80%～90%時，用200 μL移液器吸嘴劃痕。加入DMEM培養(yǎng)基，分別處理0、24和48 h后觀察，拍照，測量劃痕間距，根據(jù)公式計算劃痕愈合率：劃痕愈合率%=（0 h劃痕寬度-24 h/48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.9 Transwell實(shí)驗(yàn)

將BxPC-3和MIA PaCa-2細(xì)胞消化、離心，并以100 μL（3×105個細(xì)胞）接種于transwell上室。細(xì)胞貼壁后，上室分別加入DMEM培養(yǎng)基（無血清），下室加入含20%血清的DMEM培養(yǎng)基。于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后終止培養(yǎng)，依次進(jìn)行固定、結(jié)晶紫染色、脫色、擦去上室細(xì)胞、取膜、封片后，于顯微鏡下觀察、拍照。

1.10 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

BxPC-3和MIA PaCa-2細(xì)胞經(jīng)處理48 h后，收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取20 μg蛋白依次進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉后，一抗（1∶1 000）4 ℃溫育過夜。次日，洗膜，二抗（1∶3 000）室溫溫育2 h后，ECL法顯影、曝光。以β-actin為內(nèi)參，評價各目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.11 免疫組織化學(xué)染色

制備4 μm厚連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，抗原修復(fù)，滴加抗PKLR抗體（稀釋比例1∶100），4 ℃溫育過夜；次日滴加二抗，DAB顯色，蘇木精對比染色，中性樹膠封片。為證明PKLR抗體免疫組織化學(xué)檢測的特異性，選用PKLR陽性染色的切片，以PBS代替一抗的染色結(jié)果作為陰性對照。以著色強(qiáng)度及著色細(xì)胞數(shù)綜合計算作為PKLR陽性染色評分標(biāo)準(zhǔn)。按陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按著色陽性細(xì)胞數(shù)計分：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為 4分；染色強(qiáng)度與著色細(xì)胞數(shù)得分相乘，0～1分為陰性（-），2～4分為弱陽性（+），5～7分為中度陽性（++），≥8分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.12 免疫熒光染色

在6孔板中放置滅菌處理好的蓋玻片并接種細(xì)胞，各組細(xì)胞經(jīng)PKLR處理48 h后，依次進(jìn)行多聚甲醛固定、TritonX-100透化、牛血清封閉后，一抗（1∶500）4 ℃溫育過夜。次日洗滌，熒光二抗（1∶400）室溫避光溫育2 h。洗滌后，DAPI染色，封片，于熒光顯微鏡下拍照。

1.13 小干擾RNA轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板，分別設(shè)si-control組和si-PKLR組，次日待細(xì)胞生長至30%～50%，si-control組加入2 mL正常完全培養(yǎng)液，si-PKLR組分別加入含1.5 mL的無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)液、250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，A管加入5 μL的LipofectamineTM3000和B管加入 5 μL的si-PKLR，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行Western blot檢測、MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)。

1.14 統(tǒng)計學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)中所有的數(shù)據(jù)全部采用SPSS 25.0軟件和GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)全部采用表示；多組之間數(shù)據(jù)的比較使用單因素方差分析；對于兩個獨(dú)立樣本的互相比較采用t檢驗(yàn)；PKLR蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)法，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PKLR蛋白定位于胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中

免疫熒光染色結(jié)果顯示：PKLR的熒光信號主要定位于BxPC-3和MIA PaCa-2胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖1）。

圖1 PKLR蛋白定位于BxPC-3和MIA PaCa-2胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)（×200）Fig.1 The PKLR was mainly located in the cytoplasm of BxPC-3 and MIA PaCa-2 cells（×200）

2.2 PKLR蛋白在胰腺癌組織中呈高表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PKLR蛋白主要表達(dá)于胰腺癌細(xì)胞BxPC-3和MIA PaCa-2的細(xì)胞質(zhì)，與免疫熒光結(jié)果相一致。其在正常胰腺組織中呈陰性，在胰腺癌組織中呈陽性/強(qiáng)陽性（圖2A）。進(jìn)一步統(tǒng)計其陽性率發(fā)現(xiàn)，PKLR蛋白在胰腺癌組織中的陽性表達(dá)率和強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為75.2%（82/109）和48.6%（53/109），顯著高于其在正常胰腺組織中的表達(dá)（14.3%和7.1%，P＜0.01，圖2B）。

圖2 PKLR蛋白在胰腺癌組織中的陽性表達(dá)顯著高于在癌旁正常組織中的表達(dá)水平（×200）Fig.2 The protein expression of PKLR in normal pancreatic tissues adjacent to tumor and pancreatic cancer tissues

2.3 PKLR蛋白過表達(dá)與胰腺癌患者組織分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)

進(jìn)一步探究PKLR蛋白過表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：PKLR過表達(dá)與胰腺癌患者的組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05），但與胰腺癌患者性別、年齡、臨床分期、腫瘤大小等無明顯相關(guān)性（P＞0.05，表1）。其中，PKLR在低分化組織中的強(qiáng)陽性率（85.7%，12/14）明顯高于中分化組織（46.3%，19/41）和高分化組織（42.8%，3/7）（P＜0.030）；在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的胰腺癌組織中，PKLR表達(dá)強(qiáng)陽性率為（75.0%，45/60），亦顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織（56.5%，26/46），提示PKLR蛋白與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)（P＜0.029，圖3）。

圖3 PKLR蛋白過表達(dá)與胰腺癌組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)Fig.3 Relationship between overexpression of PKLR and clinicopathological features in patients with pancreatic cancer

表1 PKLR表達(dá)水平與胰腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系Tab.1 Relationship between PKLR expression level and clinicopathological parameters of pancreatic cancer

2.4 PKLR下調(diào)明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖

進(jìn)一步采用小干擾RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)敲減PKLR表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，PKLR在胰腺癌細(xì)胞中的蛋白水平明顯下調(diào)（圖4A）；MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，si-PKLR #1、si-PKLR #2組細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制，且呈時間依賴性（P＜0.05，圖4B）；平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相一致，敲減PKLR可顯著減少BxPC-3和MIA PaCa-2細(xì)胞的集落形成數(shù)量（圖4C），提示PKLR下調(diào)可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖能力。

圖4 PKLR下調(diào)對胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響Fig.4 Inhibition of PKLR attenuated the proliferative abilities of BxPC-3 and MIA PaCa-2 cells

2.5 PKLR下調(diào)抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移能力

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，si-PKLR #1、si-PKLR #2作用細(xì)胞0、24和48 h后，與對照組相比，si-PKLR #1、si-PKLR #2處理組細(xì)胞橫向遷移距離明顯縮短（圖5A）；進(jìn)一步的transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，PKLR表達(dá)下調(diào)后，胰腺癌細(xì)胞的縱向遷移能力明顯受到抑制（P＜0.05），（圖5B），提示敲減PKLR表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移能力。

圖5 敲減PKLR對胰腺癌細(xì)胞遷移能力的影響 Fig.5 Inhibition of PKLR attenuated the migration abilities of BxPC-3 and MIA PaCa-2 cells

2.6 PKLR下調(diào)通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transformation，EMT）途徑抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移

進(jìn)一步通過Western blot檢測PKLR對EMT標(biāo)志物的影響發(fā)現(xiàn)，si-PKLR #1、si-PKLR #2處理細(xì)胞后，上皮表型標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)明顯上調(diào)，間充質(zhì)表型標(biāo)志物vimentin及snail的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01，圖6），提示PKLR可能通過EMT途徑調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的遷移。

圖6 Western blot檢測PKLR下調(diào)后EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平Fig.6 Inhibition of PKLR attenuated the migration abilities of BxPC-3 and MIA PaCa-2 cells through the EMT pathway detected by Western blot

*:P<0.05,#:Some of the data were missing

3 討 論

PKLR作為糖酵解途徑的關(guān)鍵限速酶之一，其不僅調(diào)控糖代謝重編程，而且在類固醇和脂肪酸等能量代謝過程中發(fā)揮著重要作用［13-14］。Nie等［15］研究揭示，鹽皮質(zhì)激素受體通過miR-338-3p/PKLR信號軸調(diào)控肝癌的瓦博格效應(yīng)，進(jìn)而抑制肝癌的惡性增殖。Nguyen等［11］研究發(fā)現(xiàn)，PKLR通過誘導(dǎo)谷胱甘肽合成進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移。Rudnicka等［16］報道，PKLR在胃癌組織中異常高表達(dá)，且可正向調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、周期阻滯和凋亡。Shaikh等［18］研究亦證實(shí)，下調(diào)PKLR表達(dá)可抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的增殖、侵襲和遷移，與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。以上研究提示，PKLR在腫瘤中異常表達(dá)并與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

在本研究中，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示PKLR蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常胰腺組織；進(jìn)一步分析PKLR高表達(dá)與胰腺癌臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PKLR在晚期（Ⅲ～Ⅳ期）及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中的強(qiáng)陽性表達(dá)率（57.1%vs75.0%）均顯著高于早期（Ⅰ～Ⅱ期）和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌（47.1%vs56.5%，P＜0.05）。

Wang等［19］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP1通過調(diào)控PKLR的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)膽囊癌的增殖和轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步探究PKLR在胰腺癌演進(jìn)中的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用小RNA干擾技術(shù)敲減PKLR表達(dá)分析其對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。MTT實(shí)驗(yàn)及平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示，PKLR表達(dá)下調(diào)可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖及平板克隆形成能力；進(jìn)一步的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲減PKLR表達(dá)對胰腺癌細(xì)胞的橫向及縱向遷移能力均有明顯的抑制作用，提示PKLR在胰腺癌的增殖和遷移過程中扮演著重要角色。眾所周知，EMT進(jìn)程是促使腫瘤上皮細(xì)胞獲得較高的遷移及侵襲能力的原因之一，也是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟［19］。為此，本研究運(yùn)用Western blot檢測PKLR表達(dá)下調(diào)后對EMT相關(guān)標(biāo)志物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上皮表型標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)明顯上調(diào)，而間充質(zhì)表型標(biāo)志物vimentin及snail表達(dá)明顯下調(diào)。上述結(jié)果與本課題組前期研究結(jié)果相一致，即PKLR作為NQO1的靶蛋白，下調(diào)PKLR表達(dá)可顯著抑制NQO1誘導(dǎo)的EMT進(jìn)程［20］，提示PKLR可能通過EMT途徑促進(jìn)了胰腺癌的轉(zhuǎn)移。

總之，本研究表明，PKLR蛋白在胰腺癌組織中呈高表達(dá)，并與胰腺癌患者的組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切；敲減PKLR蛋白表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及EMT進(jìn)程，提示PKLR蛋白可能參與胰腺癌的演進(jìn)，有望成為胰腺癌早期診斷的生物標(biāo)志物和治療的靶點(diǎn)。