慢性缺氧對膠質母細胞瘤DNA修復基因表達的影響及生物信息學分析*

李瑞靜，楊威利，延興學，李紀同，王瀟娜，張耀東

(鄭州大學附屬兒童醫院/河南省兒童遺傳代謝性疾病重點實驗室/河南省兒童神經發育工程研究中心，河南 鄭州 450018)

腦膠質細胞瘤是成人中最常見的一種原發性惡性腦腫瘤，盡管中樞神經系統腫瘤非常罕見，卻是癌癥發病和死亡的重要原因，尤其是在兒童和年輕人癌癥死亡中，分別占約30%和20%[1]，其中膠質母細胞瘤(GBM)是惡性程度及病死率最高的腦膠質瘤病理類型，5年生存率不足10%，年發病率在世界范圍內不超過3/10萬，無明顯的區域差異，男性發病率略高于女性[2-3]，是最具侵襲性的亞型，患者的中位生存期約18個月[2]。目前，GBM的標準治療方案包括手術治療、結合放療和化療[4]，對于GBM患者的治療策略是在安全范圍內最大限度地進行手術切除與放療、替莫唑胺化療結合。

由于GBM腫瘤細胞浸潤性生長和受腫瘤部位的制約，手術難以完整地切除腫瘤。放化療無法特異性地識別腫瘤細胞，且容易產生耐藥性。研究發現大腦通過腦膜淋巴管與外周免疫系統相連[5]，這一發現使得腫瘤免疫治療有望成為GBM最具前景的治療策略，為其治療提供了新的方案。GBM有絲分裂活性大、微血管增生壞死且對放化療具有排斥反應。臨床上具有預后不良、合并癥多、治療方式單一等特點[6]。在所有實體腫瘤中，高級別膠質瘤的血管化最為明顯，新生血管增生與缺氧誘導的壞死已成為GBM的重要特征，這兩項特征與預后不良相關。GBM的特征在于廣泛的組織缺氧，與周圍空氣相比，即使是非腫瘤組織也顯示出較低的氧氣濃度。成年人體組織的生理氧氣狀況為2%～9%，遠低于吸入的空氣中的氧氣(20.8%)[7]。缺氧在GBM微環境中，塑造癌癥干細胞的表型，細胞異質性是該細胞的特征，并導致難以指定有效的治療方法。膠質瘤干細胞類細胞已被確定為腫瘤細胞的亞群，被認為是導致耐藥性的主要原因[8]。組織缺氧在癌細胞生長，新血管形成，浸潤，對化療、放療的耐受性及在治療復發后都具有重要作用[9]。對缺氧的適應使得癌癥在腫瘤缺氧環境中發展，介導對減少的氧氣的適應性反應的主要機制是缺氧誘導因子1(HIF-1)的激活[10]。

缺氧是GBM的攻擊行為和抵抗機制的重要原因，GBM是研究癌癥中缺氧的重要模型，缺氧誘導轉錄因子(HIFs)的上調是對缺氧環境的主要適應性細胞反應[11]。本研究通過分析GBM在慢性缺氧條件下DNA修復基因表達及信號通路變化，進一步明確慢性缺氧引起GBM的分子機制，為GBM惡性腦腫瘤的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1基因表達數據 慢性缺氧培養的人GBM數據(GSE139250)從NCBI基因表達數據庫(GEO database)中下載。本研究分析數據包含3組：21%氧氣(正常組)、1%氧氣和0.1%氧氣(缺氧組)，每組包含12個重復芯片。

1.2數據分析方法 使用limma R包對GEO芯片數據進行差異基因表達分析，使用ggplot包繪制火山圖，使用pheatmap包對基因表達數據進行熱圖繪制。通過對差異基因集進行富集分析，可以找到不同條件下的差異基因與哪些生物學功能或通路顯著性相關。使用Gene Oncology軟件對改變量≥2倍的基因進行生物過程、細胞組成和分子功能分析，使用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路分析軟件分析差異基因主要改變通路，并用String與Cytoscape軟件進行蛋白互作網絡分析。

1.3統計學處理 數據采用獨立樣本t檢驗進行差異基因表達分析，其他數據分析采用相應軟件默認統計學方法進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1GBM慢性缺氧時DNA修復差異表達基因的分析 為了明確慢性缺氧對GBM細胞DNA修復表達基因的影響，使用limma R包將慢性缺氧的GBM數據(GSE139250)分為正常組(12個樣品)和缺氧組(24個樣品)兩組，進行差異基因表達分析，設置參數P<0.05,foldchange>2(即|log2FC|>1),并使用ggplot包繪制火山圖。GSE139250數據庫中只有180個基因通過差異篩選，差異基因表達分析結果顯示慢性缺氧時GBM有3個基因表達升高，4個基因表達降低(圖1)。對DNA修復基因表達數據進行熱圖繪制(圖2)，慢性缺氧時GBM的7個基因有差異表達，其中表皮生長因子受體(EGFR)是表皮生長因子家族成員的受體，研究已證實GBM的發生、發展與EGFR信號通路密切相關。

紅色代表上調的基因，藍色代表下調的基因，黑色為差異不顯著的基因。

紅色代表基因高表達,綠色表達基因低表達,樣本分為兩個組：缺氧組和對照組。

2.2DNA修復差異表達基因的分子功能富集分析 為進一步明確DNA修復差異表達基因的主要分子生物學功能，對差異表達基因使用Gene Oncology進行主要的生物過程、細胞組分及分子功能富集分析。結果顯示差異表達基因主要參與了對紫外線輻射的反應、對DNA損傷刺激反應的調節、對光刺激的反應、細胞對非生物刺激的反應、細胞對環境刺激的反應、對電離輻射的反應、肽絲氨酸修飾等生物過程。主要的分子功能為蛋白質酪氨酸激酶活性、磷酸酶結合、肌動蛋白絲結合、蛋白質C末端結合、泛素蛋白連接酶和泛素類蛋白連接酶結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性和蛋白質異二聚體活性等。見圖3。

圖3 慢性缺氧GBM DNA修復差異表達基因的生物過程、細胞組分和分子功能富集分析

2.3差異表達基因的信號通路富集分析 KEGG通路富集以P<0.05作為顯著性富集的閾值，從KEGG富集的結果中選取最顯著的20個KEGG通路繪制散點圖，分析發現差異表達基因主要與P53信號通路、志賀氏菌、胃癌、結直腸癌、癌癥中microRNA等通路相關(圖4)。蛋白互作分析結果顯示，慢性缺氧的GBM DNA修復差異表達蛋白存在兩兩相互作用(圖5)，對差異表達基因蛋白相互作用的可信度分析結果見表1。使用Cytoscape軟件對蛋白相互作用進行可視化,使用Centiscape2.2插件分析基因在網絡中的degree,使用degree的高低顯示基因的node大小，表中PARP1和ATR代表的node degree最大,表示這兩個基因相互作用的基因比較多,屬于熱點基因(表2)。

圖4 慢性缺氧GBM DNA差異表達基因KEGG信號通路富集分析

圖5 慢性缺氧GBM DNA差異表達基因蛋白的相互作用網絡

表1 String數據庫中慢性缺氧GBM DNA差異表達基因蛋白互作可信度

表2 慢性缺氧GBM DNA差異表達基因蛋白相互作用網絡分析中的node

3 討 論

GBM是腦惡性腫瘤中病死率最高和最常見的一種，其腫瘤細胞常常呈浸潤性生長，其侵襲轉移的能力與臨床預后密切相關。GBM也被稱為多形性GBM，是一種起源于星形膠質細胞快速發展的、致死性的大腦腫瘤。GBM的發生和發展與EGFR信號通路密切相關。EGFR最常見的突變類型EGFRvⅢ在GBM的發生發展中有重要作用。射線照射對人GBM U87細胞侵襲性具有促進作用，Wnt/β-catenin通路激活和侵襲性相關基因表達的增加是其可能機制。上調谷胱甘肽過氧化物酶表達可以促進GBM細胞株的生長、遷移和侵襲[12]。GBM的發生發展是多基因參與的過程，其中IDH1、MGMT和P53在疾病發展過程中發揮了重要作用[13]。異常的表觀基因組是GBM的主要危險因素，是最惡性和致命性的人腦腫瘤[14]。DNA修復酶MGMT的甲基化過高，可防止異常甲基化修復，是GBM患者對烷基化劑(包括替莫唑胺)反應的有力預后生物標志物[15]。

GBM大部分表現為PI3K-AKT-mTOR和RAS-MAPK信號通路的激活，因此被認為是GBM中常見的致癌改變[16]。腫瘤基因通路的激活，如受體酪氨酸激酶(RTKs)的激活，是惡性膠質瘤最常見的基因改變之一。在原發性GBM中，57.4%的患者出現EGFR基因的擴增，通常伴隨該蛋白的外結構域的激活突變，而在繼發性GBM患者中占8%[17]。PDGFRA基因擴增是RTK通路中常見的基因組改變，對兒童GBM和彌漫性橋腦膠質瘤有顯著影響[18-19]。在小鼠GBM模型中，內質網未折疊蛋白響應相關蛋白IRE1控制血管生成、侵襲和間充質分化，內質網未折疊蛋白響應相關蛋白PERK可以刺激GBM的增長，但未折疊的蛋白相關響應在神經膠質瘤發生中的直接作用有待證明[20]。格列本脲下調MCT1蛋白表達，可能通過抑制MCT1的表達，削弱氫離子和乳酸的外向轉運，使得細胞內的酸化趨勢形成[21]。ABL2在GBM組織中表達較正常腦組織高，沉默ABL2表達可能通過調節pY-421cortactin的水平來抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲[22]。

有關研究表明，在基因突變的共同作用下，可能導致了GBM的形成。經過對小鼠基因突變組合分析發現，B2m-Nf1、Mll3-Nf1和Zc3h13-Rb1共同導致GBM。確定了兩個基因的突變Pten 和Zc3h13，改變了Rb1基因突變的表達，從而增加了對化療藥物替莫唑胺的抗性[23]。

綜上所述，GBM的發生與發展是多基因、多種信號通路參與的復雜生物學過程，基因突變、表觀基因組異常等均會引起GBM的形成。本研究通過生物信息學分析顯示，慢性缺氧會引起GBM中部分DNA修復相關基因表達異常，導致GBM酪氨酸激酶活性、蛋白質磷酸化和肌動蛋白異常，引起細胞DNA復制等過程中DNA損傷及細胞增殖與凋亡等，靶向DNA復制及蛋白質酪氨酸激酶激活和磷酸化過程等分子及相關信號通路，深入研究慢性缺氧引起GBM的分子機制，尋找抑制GBM遷移和侵襲的靶點，可能是GBM的潛在治療手段。