正交試驗優化參黃洗劑的提取工藝

葛桂枝，李艷，王春艷，于桂蘭，高珊，董楊，彭麗艷

（唐山市婦幼保健院 藥劑科，河北 唐山 063000）

0 引言

女性生殖系統疾病中，陰道炎的發病幾率、復發性極高，是婦科炎癥中的一大類，約占婦科疾患的70%[1]。中醫學領域劃分陰道炎至“帶下”、“陰癢”范疇，致病原理由肝脾胃功能失調，造成脾胃虛弱，引發氣、血、精生化乏源所致，加之日常生活中，患者外感風寒、內受邪熱，導致氣血不通，筋脈失養，從而使陰道炎發病且反復發作[2-3]。參黃洗劑為我院臨床經驗方，處方有苦參、黃柏、大黃、大青葉等中成藥物，處方藥性存清熱利濕、解毒化瘀、殺蟲止癢的功效，臨床常用治療各種類型的陰道炎。參黃洗劑已廣泛用于我院陰道炎患者，但由于其中藥種類較多，穩定性不易控制，因此，研究開發中藥坐浴洗劑，對臨床用藥具有重要意義。故本文綜合考慮處方中君臣藥的藥理作用及有效成分，參考相關文獻后[4-10]，以正交實驗方式，對組方做工藝優化，為參黃洗劑在醫院進一步擴大生產提供依據。

1 試藥與儀器

1.1 試藥。參黃洗劑（唐山婦幼保健院，190802-190912）自制；鹽酸小檗堿對照品（中國生物制品鑒定研究院，10805-200305）、苦參堿對照品（中國生物制品鑒定研究院，110805-200305）均為含量測定用。甲苯（天津富宇精細化工有限公司，13081161）、三氯甲烷（國藥集團化學試劑有限公司，20130305）、濃氨（天津市大茂化學試劑廠，20140320）均為分析純。甲醇、乙腈均為色譜純。純化水自制。

1.2 儀器。島津高效液相色譜儀（SPD-20A，島津企業管理中國有限公司）；電熱鼓風干燥箱（101型，北京科技永光儀器有限公司）；恒溫水浴振蕩器（SHA-C，常州國華電器）；精密電子天平；加熱蒸發皿（采博科技有限公司）；磁力加熱攪拌器；UV-2501PC紫外分光光度儀。

2 方法與結果

2.1 指標性成分含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：EclipseXOB-C18（5 μm，4.6×150 mm）；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（酸堿度6.8，50：50）（乙腈-0.1%磷酸溶液：十二烷基磺酸鈉慰問100 mL：0.1 g）；流速：1 mL·min-1；檢測波長：227 nm；進樣量為：20 μL。

2.1.2 溶液的配制

（1）對照品溶液配制。嚴格稱取適量的鹽酸小檗堿標準品及苦參堿標準品分別于50 mL容量瓶中，以清水作為溶解稀釋液，溶解至適量刻度，即得相應的對照品溶液。對上述兩種儲備液進行適度量取，量取量為0.5，1，2，4，6 mL，置入10 mL容量瓶當中，明確取樣劑量，以編號方式對各儲備液進行標注，稀釋至刻度后，將各儲備液進行混合。

（2）供試品溶液配制。量取10 mL參黃洗劑，以20 mL清水對其進行稀釋處理，添加2.5 mL濃氨試液，對三氯甲烷進行提取，每次15 mL，振蕩搖勻，震蕩次數2次左右，使提取液充分融合，過濾，加熱蒸發皿蒸干濾液，殘渣置入10 mL量甁中，以清水進行溶解，搖勻，0.45 μm針式過濾器濾過，續濾液即為供試品溶液。

（3）陰性樣品溶液的制備。按參黃洗劑的藥材配比取缺少苦參黃柏的其他中藥，按供試品制備方法，對苦參黃柏進行陰性樣品處理。

2.1.3 系統適應性實驗:分別取上述對照品、供試品、陰性樣品10 mL，操作方式與“2.1.1”相一致，色譜條件進樣并對其進行記錄，陰性樣品在苦參黃柏兩處無吸收峰。

圖1 苦參堿和小檗堿HPLC圖（A.對照品溶液；B.陰性對照；C.供試品溶液：1.苦參堿，2.小檗堿）

2.1.4 標準曲線的建立：量取鹽酸小檗堿標準品、苦參堿標準品及不同濃度混合對照品溶液，按照“2.1.1”操作方式行檢測，X為對照品進樣量，Y為峰面積值，制作標準曲線。曲線方程分別為：Y=1.4395×104X-2.7464×103，r=0.9996；Y=4.2921×105X+1.9126×103，r=0.9999，苦參堿的濃度在0.15～4.2 μg·mL-1、鹽酸小檗堿在0.4～4.8 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.1.5 精密度試驗：量取混合對照品溶液，按照“2.1.1”操作方式，共實施操作8次，對小檗堿和苦參堿兩種成分的峰面積RSD為0.65%和0.75%進行計算匯總。

2.1.6 重復性試驗：取參黃洗劑樣品6份，分別參考“2.1.3”操作方式，對供試品溶液進行配制，進樣測定并記錄峰面積，小檗堿平均含量2.477 g·L-1和苦參堿平均含量0.4658 g·L-1，其RSD值分別為1.3%和1.6%（n=6）。

2.1.7 穩定性試驗：精密量取上述供試液1份，分別在0，2，4，8，12，24進樣1次，小檗堿RSD為0.6%，苦參堿RSD為0.7%，提示供試品溶液在24 h內穩定可控。

2.2 正交實驗。參考中藥提取相關文獻為背景，選用提取液中君臣藥鹽酸小檗堿、苦參堿2兩種指標性性成分并計算干膏得率，進行以提取次數、浸泡溫度（℃）、浸泡時間（h）、料液比（g·mL-1）為考察因素的單因素分析試驗。根據單因素分析實驗，正交試驗因素水平表內容如表1，各因素對參黃洗劑提取率影響順序為：D＞C＞A＞B。由表3的極差結果可知，A，B，C必需選擇對正交結果影響最高的水平。綜合K值與R值，最佳提取工藝為：A2B2C3D2，即2次提取，40℃浸泡，共浸泡2 h，料液比1:10（g· mL-1），詳見表1、表2和表3。

表1 正交實驗因素水平表

表2 正交實驗結果表

表3 方差分析結果

2.3 最佳提取工藝的驗證。根據優選方案，開展平行提取3次，比對可見，提取量指標均較為良好，表2正交試驗結果匯總，組合測得指標值，平行實驗所得數據之間無明顯差異重現性理想，詳見表4。

表4 驗證試驗

3 討論

以唐山婦幼保健院治療陰道炎的參黃洗劑配方作為本次研究內容。現今醫療領域中，陰道炎疾病治療用藥藥物劑型多為栓劑、膏劑，患者在用藥過程中，存使用不便，污染衣物等情況，對患者日常生活、工作存在影響性。而參黃洗劑用于陰道炎治療相比于其他類型制劑具有直接接觸病灶，使用方便簡單，適合患者家中使用，因此本研究針對中藥材活性成分提取，并就提取率以正交試驗方式，篩選最佳水提工藝，使方劑更好的應用于患者。

君、臣、佐、使等是對中藥材在中醫組方特征及地位的劃分。但在現代醫學中，中藥成分、所含物質等存復雜性，藥性及用藥效果具有多面性，加之對部分中成藥物藥效、藥性等尚不清楚，因此在中藥制劑質量分析中，首選君藥、臣藥，進行研究分析。該實驗選取了指標性成分苦參、黃柏。

通過正交試驗最終以提取2次，浸泡溫度40℃，浸泡2 h，料液比1:10（g· mL-1），合并兩次煎液，濾過，藥材提取液濃縮至1000 mL。得出：制備工藝穩定及可行性強，為參黃洗劑更好工業化生產提供依據。