兩種γ-干擾素釋放試驗試劑盒在結核病診斷中的比較研究

束玉鳳，孫正松，王金富

（江蘇揚州市第三人民醫院，江蘇 揚州 211500）

0 引言

結核病是一種慢性傳染病，由結核分枝桿菌（簡稱結核桿菌）入侵引起，在全球范圍內稱為感染性疾病“頭號殺手”。據不完全統計，全球22個肺結核高疫情國家中，就包括中國，當前我國現有活動性肺結核患者約170萬人，每年確診肺結核的患者有100萬人，占全球發病人數的14.3%[1]。所以說在診斷肺結核疾病的過程中，應該落實早診斷、早治療[2]。目前，病理學診斷和細菌學診斷是結核病的主要確診手段，但是細菌學檢查的陽性率較低、耗時長，臨床上廣泛應用的結核菌素皮膚試驗（Tuberculin skin test，TST）又受接種卡介苗、非結核分枝桿菌感染、機體免疫力等因素的影響，易產生假陽性、假陰性結果[3]，所以這種診斷方法準確性仍待考察。因此尋找一種準確、快速、可靠的診斷結核病方法十分迫切。近年來，以T細胞免疫為基礎的體外γ-干擾素釋放試驗（interferon -γ release assays，IGRA）以其較高的靈敏性及特異性備受關注[4-5]，在歐美等發達國家廣泛應用于結核病的診斷[6]。近些年來，隨著我國醫療技術的發展，國內有關IGRA診斷方法的研究越來越多，但是大多數研究選擇的進口試劑價格昂貴，因此IGRA檢測試劑需要國產化[7]。鄭州安圖生物工程股份有限公司生產的結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒磁微粒化學發光法（簡稱安圖試劑）和北京萬泰生物藥業有限公司生產的結核桿菌相關γ-干擾素檢測試劑盒體外酶聯免疫法（簡稱萬泰試劑）均選取了卡介苗及大多數非結核分枝桿菌沒有的6-kDa early secreted antigenic target（ESAT-6）和10-kDa culture filtrate protein（CFP-10）作為結核桿菌特異性抗原[8]，因而IGRA不受卡介苗接種和非結核桿菌感染的影響，因此在結核桿菌潛伏感染或活動結核病的診斷過程中可以進行輔助診斷。本次研究針對在結核病診斷中應用兩種試劑的敏感度、特異度、一致性進行深入分析，進而研究這種方法的作用效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料。擇取2018年1～5月在揚州市第三人民醫院住院確診結核患者87例，年齡19～93歲，平均（54±3）歲，根據痰涂片結果分為涂片陰性結核病組61例，涂片陽性結核病組26例。

1.2 所有患者均根據《傳染性肺結核診斷標準及處理原則》確診為肺結核[10]：①抗酸桿菌檢查利用分離培養法、痰標本涂片鏡檢檢查結果二次以上陰性；②胸部X線攝片結果為活動性肺結核征象；③均存在咳嗽、咳痰、疲乏、胸悶氣短、胸痛、低燒、食欲不振、血痰或咯血、體重減輕、月經失調等癥狀；④5個單位結核菌素（OT或 PPD-T）皮內注射，72 h注射局部硬結反應直徑超過5 mm；⑤肺部病理標本經病理學診斷為結核病變。具備①②或同時伴有③④中一項者，以及具備①⑤者，均可確診。80例非結核組：包括非結核性肺部疾病患者67例和健康志愿者13名，其中男l例，女16例；年齡24～82歲，平均54歲；PPD試驗均為陰性，為結核分枝桿菌（MTB）染低暴露風險人群。本次研究入選患者均知曉研究并自愿加入，本次研究通過醫院倫理委員會審核批準。

1.3 儀器與試劑。ALISEI酶標儀、AUTO2000化學發光儀、電恒浴箱、北京萬泰生物藥業有限公司生產的結核桿菌相關γ-干擾素檢測試劑盒（體外酶聯免疫法）（簡稱酶免試劑）和鄭州安圖生物工程股份有限公司生產的結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒（磁微粒化學發光法）（簡稱發光試劑）。

1.4 方法

1.4.1 安圖試劑檢測步驟：將陰性對照培養液（N）、陽性對照培養液（P）、測試培養液（T）各100 μl分別加到對應的培養孔內，采集的新鮮全血4 mL置入肝素抗凝管保存，在8 h內檢驗完畢，將全血標本輕柔顛倒混勻3～5次后按“N”、“T”、“P”的順序加入到含有培養液的細胞培養板相應的孔內，1 mL/孔，蓋緊培養板上蓋并直立置于37℃溫箱中培養培養16～24 h后取出，靜置1 min小心開蓋，從每個細胞培養板孔中吸取上清液200 ul進行γ-干擾素（IFN-γ）含量的檢測。結果判斷通過參考試劑盒說明書鑒定。

1.4.2 萬泰試劑檢測步驟：用肝素抗凝真空采血管采集新鮮全血4 mL，所有全血標本在2 h內緩慢顛倒混勻3～5次后按“N”、“T”、“P”的順序加入到對應的培養管中，1 mL/管，并直立置于37℃溫箱中培養培養20～24 h后取出，以3500 r/min離心10 min收集上清液，用ELISA法定量檢測上清液中γ-干擾素的含量。參結果判斷通過參考試劑盒說明書鑒定。

1.5 統計學分析。采用SPSS 13.0軟件進行分析，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 發光法和酶免法在不同組別檢出率。發光試劑在結核病組、菌陽組、菌陰組的檢出率分別為74.71%、75.41%、73.08%；酶免試劑在結核病組、菌陽組、菌陰組的檢出率分別為68.97%、65.57%、76.92%，差異無統計學意義（P＞0.05）；發光試劑和酶免試劑在非結核肺部疾病組的檢出率分別為25.32%，22.78，差異無統計學意義（P＞0.05）。發光試劑在老年組肺結核和中青年組肺結核患者中的檢出率分別為63.64%、79.63%，酶免試劑在老年組肺結核和中青年組肺結核患者中的檢出率分別為57.58%、74.07%，差異無統計學意義（P＞0.05），詳情見表1、表2。

表1 不同組別的檢測結果[n（%）]

表2 兩種試劑盒對中青年結核病患者與老年結核病患者檢測的檢出率比較

2.2 方法學比較。發光試劑和酶免試劑的敏感度分別為74.71%，68.97%，特異度分別為74.68%，77.22%，準確度分別為74.70%，72.89%，差異無統計學意義（P＞0.05），詳情見表3。

表3 兩種試劑盒靈敏度、特異度、預測值和似然比比較（n，%）

3 討論

本院是結核病定點醫院之一，從臨床上看，結核潛伏感染率較高人群為非結核肺部疾病患者，因此在非結核肺部疾病患者中IGRA檢測結果陰性的排除診斷價值明顯超過檢測結果陽性的診斷價值，IGRA是當前最有效診斷各型結核病的輔助手段，具有快速有效的特點，尤其對菌陰結核病的應用價值更高。目前化學發光法用于檢測結核感染，使得傳統的IGRA檢測更加快捷，全自動化，人為干擾因素減少，不僅能提高結核的診斷效率，更加節約人力資源，該方法學適宜在臨床推廣應用。

目前，全球已經有25個國家發布了應用指南。美國CDC建議，PPD試驗當前完全可以被IGRA替代；瑞士肺科協會建議，必須在接受抗腫瘤壞死因子α治療前，進行IGRA結核桿菌感染篩查；WHO組織和歐洲疾病預防控制中心也相繼發布了應用指南。不僅如此，中國衛生和計劃生育委員也將IGRA檢測加入了最新頒布的肺結核診斷標準中[14]。IGRA 是一個非常有效的輔助診斷方法，在臨床上可以作為痰菌陰性肺結核診斷金標準之外的一種技術，發展前景較高。